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研究背景随着生活饮食结构的改变和遗传因素的作用,肥胖人群数量快速上升。由于机体摄入和消耗的能量长期失衡,过多的能量以甘油三酯的形式存储在白色脂肪细胞中,表现为肥胖。目前肥胖主要通过手术或奥利司他等药物进行治疗,以减少机体能量摄入。但这产生了许多与之相关的副作用,仍缺乏行之有效的方法。因此有研究者提出可以通过增加能量消耗的方法治疗肥胖。棕色脂肪组织（brown adipose tissue,BAT）是位于人体肩胛部位的有益脂肪,包含大量线粒体,其中高水平的解偶联蛋白会消耗甘油三酯和葡萄糖产生热量,因此调控棕色脂肪功能对于治疗肥胖具有重要意义。Tribbles homolog 1（Trib1）属于Tribbles假激酶家族,在肿瘤发生和巨噬细胞极化中起关键作用。全基因组分析显示Trib1表达与血脂水平高度相关,但Trib1与脂肪组织代谢之间的关系尚不明确。小檗碱是中药黄连（Coptis chiensis Franch.）中分离得到的异喹啉生物碱,现代药理研究发现小檗碱可以降低肥胖小鼠的体重和血脂,改善高血脂症造成的炎症反应和胰岛素抵抗,促进棕色脂肪激活提高能量消耗,是治疗肥胖的潜在药物。有研究发现小檗碱可以通过提高小鼠肝脏LDLR和TRIB1的蛋白表达,从而降低小鼠血清甘油三酯水平,但小檗碱在BAT能量代谢中的作用是否与Trib1有关仍需探究。研究目的本课题从体内外两方面探讨Trib1对棕色脂肪组织能量代谢的调控作用,并阐明小檗碱提高棕色脂肪代谢功能治疗肥胖的分子机制,为代谢性疾病的治疗提供科学依据。研究方法1.对1、6和12月龄的db/db小鼠心肌组织进行RNA-Sequencing,检测脂代谢障碍发展过程中的共同差异基因并进行靶点筛选。采用RT-PCR测定Trib1在C57BL/6J小鼠各组织器官和3T3-L1脂肪细胞不同分化阶段中的表达水平。C57BL/6J小鼠腹腔注射给与β3-肾上腺素受体激动剂（1 mg/kg）,采用HE染色,Western blot和RT-PCR检测小鼠Trib1和产热相关蛋白及基因表达水平。2.采用CRISPR/Cas9技术建立Trib1基因敲除小鼠进行繁育,对其基因型进行鉴定。采用体脂仪,组织HE染色,ELISA和动物代谢分析系统等方法检测Trib1敲除对小鼠体重、血脂和产热的影响。Trib1敲除小鼠腹腔注射给与β3-肾上腺素受体激动剂（1 mg/kg）,采用体脂仪,组织油红染色,动物代谢分析系统和透射电镜等方法检测Trib1敲除对小鼠棕色脂肪组织代谢水平的影响。3.通过原核质粒构建TRIB1-GST融合蛋白进行蛋白质体外结合实验（Pull down assay）,并对Trib1敲除小鼠和野生型小鼠棕色脂肪组织进行转录组测序（RNA-Sequencing）,检测Trib1调控棕色脂肪功能的关键分子。采用Western blot,RT-PCR,线粒体复合物酶活性检测试剂盒和ATP水平检测试剂盒探究Trib1敲除对棕色脂肪线粒体呼吸链的影响。进一步通过真核质粒在3T3-L1脂肪细胞上过表达Trib1,采用RNA-Sequencing,细胞油红染色,Mitotracker线粒体染色和Seahorse能量代谢仪验证Trib1调控棕色脂肪功能的靶点和机制。4.ob/ob小鼠灌胃给与小檗碱（100 mg/kg）8周后,采用胰岛素耐量实验,体脂仪,组织油红染色和ELISA检测小檗碱对肥胖小鼠体重、血脂和炎症的影响。通过动物代谢分析系统,寒冷环境体温测定,RT-PCR和Western blot探究小檗碱对肥胖小鼠棕色脂肪产热的影响。进一步采用siRNA敲低Trib1,通过RT-PCR,Western blot,Bodipy染色和Seahorse能量代谢仪检测Trib1敲低对小檗碱调控能量代谢的影响。研究结果1.体内实验表明,在db/db小鼠心肌组织中,随着小鼠脂质代谢障碍的进展Trib1表达显著下调。在C57BL/6J小鼠棕色脂肪中,Trib1的基因表达水平显著高于其他组织。在冷刺激和β3-肾上腺素受体激动剂提高棕色脂肪功能的模型中,Trib1的表达水平显著上升。体外实验表明,随着3T3-L1脂肪细胞的脂滴蓄积增多,Trib1表达逐渐降低,表明Trib1直接参与脂肪组织代谢。2.利用Trib1敲除小鼠对其表型进行测定,结果显示Trib1敲除小鼠血脂水平显著上升,棕色脂肪细胞脂滴增大和产热关键蛋白UCP1表达显著降低,并伴随着瘦素和胰岛素抵抗,提示Trib1对棕色脂肪代谢功能具有调节作用。进一步利用β3-肾上腺素受体激动剂处理Trib1敲除小鼠,结果显示Trib1敲除损害棕色脂肪的脂质代谢和产热功能,使小鼠棕色脂肪线粒体肿胀,线粒体膜结构破坏。3.在动物水平上,通过RNA-Sequencing和Pull Down实验发现,Trib1敲除通过影响电子呼吸链活性破坏了线粒体动力学稳态,进而导致其结构损伤和脂肪代谢功能障碍。本研究在3T3-L1前脂肪细胞中过表达Trib1对其进行验证。体外实验结果表明Trib1的过表达提高细胞基础代谢水平,而加入抑制剂后Trib1的作用被抑制。4.小檗碱（100 mg/kg）口服给与ob/ob自发性肥胖小鼠8周可以显著降低小鼠的体重和血脂水平,并提高ob/ob小鼠棕色脂肪中Trib1和线粒体呼吸链复合物Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ的表达水平,增加线粒体拷贝数和线粒体脂肪酸氧化相关基因的表达水平,提高了肥胖小鼠棕色脂肪的线粒体功能。在3T3-L1脂肪细胞中加入siRNA干扰Trib1的表达后,小檗碱减少脂滴和增加细胞呼吸代谢的能力受到抑制。结论Trib1敲除可破坏小鼠棕色脂肪产热,并诱导高血脂和肥胖的发生。进一步证明Trib1敲除降低了线粒体呼吸链复合物酶活性,导致线粒体融合和分裂的失衡,随后导致线粒体结构损伤和脂质代谢功能障碍。体外过表达Trib1可以减少脂滴蓄积,增加线粒体数量,增强脂肪细胞的呼吸代谢水平。在脂肪细胞中加入siRNA干扰Trib1的表达后,小檗碱减少脂滴和增加细胞呼吸代谢的能力受到抑制。表明Trib1调节小鼠线粒体和棕色脂肪细胞的功能,有望成为治疗高脂血症、脂肪肝和肥胖等代谢疾病的新靶点。