DDT和BHC等有机氯农药(OCPs)曾作为杀虫剂在世界各国被广泛而大量生产与使用,但由于其具有难降解、高残留、脂溶性,可通过食物链生物富集及放大等特征,对环境生态、动植物与人类产生了极大的危害而已被禁用二十多年。大量研究表明,DDT和BHC及其代谢产物在当前环境和生物体内仍可检出,具有地域性差异,在某些局部地区环境和人体内(特别是脂肪组织)的检出率和检出水平还比较高。近年研究提示,OCPs作为持久性有机污染物(POPs)具有内分泌干扰作用,可能与男性精子数减少、精子活力下降、男性不育症患者增加、睾丸癌和前列腺癌发病率增高等,以及女性性早熟、子宫内膜异位症、子宫癌、卵巢癌和乳腺癌等发生率增加有关。因此,DDT和BHC等有机氯农药在体内的残留对人体健康的危害,特别是对生殖系统的危害日益受到人们的广泛关注,其生殖与发育毒性成为目前的研究热点。本课题人群研究部分特选择1985年女性居民脂肪样品调查DDT残留水平为全国之冠的湖北省天门市(曾经的棉产区)作为调查点,检测当地人群中有机氯农药的残留水平,分组研究其对体内相关生殖激素(FSH、LH、E2和P)和基因及蛋白(α-ER、β-EP和GnRH)表达水平的影响,结合整体动物染毒实验,以期探索有机氯农药的内分泌干扰效应。第一部分p,p’-DDE和B-BHC联合作用对孕小鼠生殖及其胎仔发育的影响目的:研究p,p’-DDE和B-BHC联合作用对孕小鼠生殖及其胎仔发育的影响。方法:以p,p’-DDE和B-BHC作为受试物,用不同浓度(p,p’-DDE和β-BHC分别为10 mg/kg/次+10 mg/kg/次;5 mg/kg/次+5 mg/kg/次;1 mg/kg/次+1 mg/kg/次;对照组灌胃同体积大豆油),于昆明种小鼠(清洁级)妊娠第12～14d期间每天给动物染毒1次。从动物妊娠0天至第18天(动物被处死之日),每天称量小鼠体重,观察其生长变化。于妊娠第18d断头处死孕小鼠,收集血液37℃分离血清,-20℃保存,用于孕鼠血清雌二醇(E2)和孕酮(P)测定(磁性分离酶联免疫法)。常规剖检母鼠,取心、肝、肾、脾、垂体、卵巢、子宫、胎盘等称重,计算各脏器系数和子宫腔内液重;计数卵巢中的黄体,检查子宫着床数,记录活胎数、死胎、吸收胎数,外观畸形胎数;记录每窝胎仔数,测定胎仔的体重、身长、尾长、腹围、肛殖距(AD)、性别比。采集胎盘组织样本,于无菌生理盐水中漂洗后,迅速置于液氮中速冻,然后转入-80℃冰箱保存,用于胎盘组织中α-ER、GnRH和β-EP mRNA表达水平测定(RT-PCR法)。用Spearman方法分析胎盘组织基因表达水平与血中激素含量之间、胎盘组织基因表达水平与胎仔肛殖距及雌雄比之间、血中激素含量与胎仔肛殖距及雌雄比之间的相关关系。结果:①对母鼠的影响:随着受试物剂量的加大,孕小鼠体重和增重下降,孕鼠肝脏重量和脏体比增加,p,p’-DDE和B-BHC联合染毒可使孕鼠子宫增重,脏/体比值上升,子宫腔内液增多,着床数减少,血清E2和P的含量增高(P<0.05)。②对胎仔发育的影响:p,p’-DDE和B-BHC联合染毒,可使活胎数减少,死胎、吸收胎、畸形胎仔数增加,胎仔肛殖距和雌雄比增加,组间差异比较有显著性(P<0.05),胎盘组织α-ER和GnRH mRNA表达上调,而β-EP表达下调,组间差异比较有显著性(P<0.05)。③相关性分析表明,血清E2、P的含量与胎盘组织中α-ER、GnRH呈正相关,而与β-EP mRNA的表达水平呈负相关。胎仔肛殖距、雌雄比与胎盘组织中α-ER、GnRH呈正相关,而与β-EP mRNA的表达水平呈负相关。孕鼠血清P含量与胎仔雌雄比之间表现为正相关关系(P<0.05)。结论:p,p’-DDE和B-BHC联合作用在雌(女)性表现为类雌激素效应,可干扰生殖过程,导致发育障碍,可致后代雄性雌性化。第二部分有机氯农药污染区产妇静脉血清中DDT和BHC残留水平测定目的:测定有机氯农药污染区产妇静脉血清中DDT和BHC残留水平,以了解目前人群的农药残留情况。方法:抽取2004年1月1日至4月30日在湖北省天门市妇幼保健院住院分娩的71例产妇的静脉血,应用气相色谱法(GC)检测血清中DDT和BHC的8种异构体的残留水平。结果:①该测定方法的平均加标回收率和相对标准偏差分别为87.3%～94.6%,1.8%～6.8%;最低检测限为0.0005μg/L。②8种异构体的检出率为7.04%～47.89%,检出范围为0.0～147.7μg/L;平均检出量以γ-BHC(11.88±27.65μg/L)和o,p’-DDT(8.47±19.33μg/L)为最高。③本次共检测71例产妇血清,总有机氯检出率为87.32%(62/71),检出水平为37.48151.24μg/L(0.0～248.1μg/L)。其中9例均未检出目标成分作为对照组(9/71),26例总有机氯含量在2.1～9.7μg/L之间作为低残留组(26/71),17例总有机氯含量在12.6～39.6μg/L之间作为中残留组(17/71),19例总有机氯含量在54.5～248.1之间作为高残留组(19/71),以便对相关生物学效应指标进行对比分析。结论:DDT和BHC等有机氯农药在我国目前某些人群中残留水平还比较高,有些产品(如林丹和三氯杀螨醇)可能仍在局部地区非法使用,继续监测有机氯农药在环境和人体内的残留很有必要。第三部分抽样人群流行病学调查目的:为了解有机氯农药的生殖和发育毒性作用,分析其内分泌干扰效应的影响因素,排除混杂因素的干扰,增加组间各检测指标的可比性。方法:采用问卷调查的方法,对被抽样的孕妇于住院分娩后2天内由经过培训的调查员按照《孕(产)妇健康情况调查表》的要求逐项询问和检查。结果:①问卷调查的合格率为100%(71/71)。②孕妇体内有机氯农药残留水平的增加可导致既往不良妊娠结局次数的上升(P<0.05)。③孕妇体内有机氯农药残留水平可能与婴儿平均出生体重的改变有关(P<0.05)。④体内不同有机氯农药残留水平的孕妇及其配偶在年龄、职业分布、接触有害物理和化学因素、孕期用药、吸烟和饮酒、孕期营养和睡眠、家族史等方面未见显著性差异(P>0.05)。结论:通过人群流行病学调查,增强了其他实验结果解释的可靠性。同时说明体内有机氯农药残留可能与生殖及发育障碍有关。第四部分产妇体内有机氯农药残留对血中4种生殖激素的影响目的:研究产妇体内有机氯农药残留对孕妇静脉血和脐带血中FSH、LH、E2和P水平的影响。方法:采集2004年1月1日至4月30日在湖北省天门市妇幼保健院住院分娩的71例产妇的静脉血和脐带血,采用磁性分离酶联免疫法测定产妇静脉血和脐带血FSH、LH、E2和P的含量。用Spearman法分析血中总有机氯残留水平与产妇血及脐带血中4种生殖激素之间、产妇血与脐带血中FSH、LH、E2和P的含量之间的相关关系。结果:①随着产妇体内有机氯农药残留水平的升高,产妇静脉血FSH、E2、P和脐带血FSH、LH、E2含量呈上升趋势(产妇血:FSH从未检出组0.83 mIU/ml增加到高残留组2.27 mIU/ml,P从264.04 ng/ml增加到327.22 ng/ml,E2从41.80ng/ml增加到中残留组54.99 ng/ml;脐带血:FSH从未检出组1.41 mIU/ml上升到高残留组2.91 mIU/ml,LH从0.60 mIU/ml上升到2.07 mIU/ml,E2从12.53ng/ml上升到中残留组24.03 ng/ml),而静脉血LH和脐带血中P呈下降趋势(产妇血LH从未检出组1.47 mIU/ml下降到高残留组0.63 mIU/ml,脐带血P从804.47 ng/ml下降到604.70 ng/ml),均有剂量依赖性关系(P<0.05)。②相关性分析表明,高残留组农药残留水平与产妇血E2、P呈负相关(r=-0.5158,P=0.0238;r=-0.6491,P=0.0026)。产妇血FSH与脐带血FSH、LH、E2,产妇血LH与脐带血P,产妇血P与脐带血LH、E2之间呈正相关;而产妇血FSH与脐带血P,产妇血LH与脐带血FSH、LH,产妇血E2与脐带血FSH,产妇血P与脐带血P之间呈负相关(P<0.05)。结论:人体内有机氯农药残留可显著干扰血中生殖激素水平。第五部分产妇体内有机氯农药残留对胎盘和脐带组织α-ER、β-EP、GnRH mRNA表达水平的影响目的:研究产妇体内有机氯农药残留对胎盘和脐带组织α-ER、β-EP、GnRHmRNA表达水平的影响。方法:采集2004年1月1日至4月30日在湖北省天门市妇幼保健院住院分娩的71例产妇的胎盘和脐带组织样,采用RT-PCR检测胎盘和脐带组织α-ER、β-EP、GnRH mRNA的表达水平,用Spearman法分析血中农药残留含量与组织基因表达水平、血中激素含量与组织基因表达水平、以及胎盘和脐带组织基因表达水平之间的相关关系。结果:①体内有机氯农药残留可诱导胎盘与脐带组织α-ER和β-EP基因表达上调(胎盘组织:α-ER mRNA表达从未检出组1.62递增到高残留组2.42,β-EP从0.36递增到0.68;脐带组织:α-ER从1.49上升到2.14,β-EP从0.24上升到0.46),有剂量依赖性关系(P<0.05)。胎盘GnRH mRNA的表达虽也有随体内残留水平的升高而加强的趋势,但组间差异无统计学意义(P>0.05)。在脐带组织未检测到GnRH mRNA的表达。②相关性分析表明,低残留组产妇静脉血中总有机氯残留水平与胎盘及脐带组织α-ER mRNA的表达水平呈负相关(r=-0.4874,P=0.0116;r:-0.4815,P=0.0127),而与胎盘组织GnRH mRNA的表达呈正相关(r=0.4870,P=0.0116)。胎盘与脐带组织α-ER和β-EP相互之间呈正相关,而胎盘GnRH与脐带α-ER、β-EP呈负相关。胎盘组织α-ER与脐带血E2,胎盘组织β-EP与产妇血FSH及脐带血FSH、E2,脐带组织α-ER与脐带血E2,脐带组织β-EP与产妇血FSH、P及脐带血E2之间呈正相关;而脐带血P与胎盘和脐带组织α-ER、β-EP之间呈负相关(P<0.05)。结论:产妇体内有机氯农药残留可干扰胎盘和脐带组织某些环境应答基因的表达。第六部分产妇体内有机氯农药残留对胎盘组织α-ER、β-EP、GnRH蛋白表达水平的影响目的:探讨产妇体内有机氯农药残留对胎盘组织α-ER、β-EP、GnRH蛋白表达水平的影响。方法:采集2004年1月1日至4月30日在湖北省天门市妇幼保健院住院分娩的71例产妇的胎盘组织样,运用SABC免疫组化方法检测胎盘组织α-ER、β-EP、GnRH蛋白的表达水平。用Spearman法分析血中农药残留含量与组织蛋白表达水平、组织蛋白与基因表达水平、组织蛋白表达水平与血中激素含量之间的相关关系。结果:①产妇体内有机氯农药残留可诱导胎盘组织α-ER、β-EP、GnRH蛋白的表达(α-ER从未检出组128.80递增到高残留组149.70,β-EP从102.98递增到121.17,GnRH从127.75递增到153.95),但只有后者(GnRH)组间差异有显著性(P<0.05)。②相关性分析表明,低残留组血中T-OCPs(总有机氯)残留水平与胎盘组织中α-ER蛋白的表达呈负相关(r=-0.5326,P=0.0124);而与GnRH蛋白的表达呈正相关(r=0.6210,P=0.01 03)。胎盘组织α-ER、β-EPmRNA与胎盘组织α-ER、β-EP蛋白,胎盘GnRH蛋白与GnRH mRNA表达水平之间呈正相关;而胎盘GnRH蛋白与胎盘α-ER、β-EP mRNA,胎盘GnRHmRNA与胎盘α-ER、β-EP蛋白呈负相关。胎盘组织α-ER蛋白表达水平与产妇血P及脐带血E2含量,胎盘β-EP蛋白与产妇血FSH、脐带血FSH、E2含量之间呈正相关;而脐带血P与胎盘α-ER、β-EP蛋白之间呈负相关(P<0.05)。结论:产妇体内有机氯农药残留可干扰胎盘组织α-ER、β-EP、GnRH蛋白的表达。综上所述,DDT和BHC及其代谢产物在本研究目标人群中的残留水平还比较高,且o,p-DDT与γ-BHC是产妇血中最主要的残留成分,推测某些有机氯农药(如林丹和三氯杀螨醇)可能仍在该地区使用。p,p’-DDE和B-BHC联合作用在雌(女)性表现为类雌激素效应,可致后代雄性雌性化。产妇体内有机氯农药残留可干扰血中生殖激素水平,诱导胎盘和脐带组织某些环境应答基因(如α-ER、β-EP、GnRH)的表达,干扰生殖过程,导致发育障碍。但具体机制有待于进一步研究。本研究的创新点有:①将动物实验与人群研究有机地结合,并通过流行病学调查,排除了影响有机氯农药致内分泌干扰的混杂因素,增强了实验结果的可比性。研究表明,体内有机氯农药的残留可干扰血中生殖激素水平,导致产妇静脉血FSH、E2、P和脐带血FSH、LH、E2含量增高,而静脉血LH和脐带血中P水平降低;可诱导人胎盘和脐带组织α-ER、β-EP及GnRH基因与蛋白的表达。②率先进行p,p’-DDE和B-BHC联合染毒孕期小鼠的研究,观察其生殖和发育毒性。结果显示,p,p’-DDE和B-BHC联合作用可使孕鼠子宫增重,腔内液增多,着床数减少,血中E2和P含量上升,诱导胎盘组织α-ER与GnRH基因的表达,而抑制β-EP基因的表达;可使活胎数减少,而死胎、吸收胎、畸形胎仔数增多;导致胎仔肛殖距与雌雄比上升。