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前言虫媒病毒（Arboviruses）是指通过吸血节肢动物叮咬敏感脊椎动物宿主而在人畜间进行传播的一类病毒,故可导致人畜共忠病。国际上已发现537种,其中130余种与人类传染性疾病有关。目前,虫媒病毒已成为世界范围内的严重公共卫生问题。随着国际交往的日益频繁,境外虫媒病毒病传入我国的可能性也显著增加,因此,同时、快速、准确的检测虫媒病毒的感染具有重要的意义。多重RT-PCR（Multiplex RT-PCR,M-RT-PCR）是在普通RT-PCR的基础上发展起来的RT-PCR检测技术,是在一个反应体系中加入两对或两对以上的引物,用于同时扩增两个或两个以上的目的基因。不仅能同时检测多种病原,保持普通RT-PCR敏感性高和特异性强的特点,而且具有节约模板和时间等一系列优点。本研究以日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）、黄热病毒（YellowFever Virus,YFV）、西尼罗病毒（West Nile Virus,WNV）和圣路易斯脑炎病毒（St.Louis encephalitis virus,SLEV）四种虫媒病毒为研究对象,利用M-RT-PCR技术,设计针对以上病毒的特异性引物进行同步多重检测。目的在于初步建立检测四种虫媒病毒的M-RT-PCR方法,为检测蚊子携带一种或多种病毒提供了一种快速、准确、可靠的诊断技术,也使得国境口岸大规模筛查和日常蚊虫的流行病学监测更加高效、快捷。材料与方法1、引物设计根据GenBank中已经发表的JEV、YFV、WNV和SLEV的全基因序列,利用DNAStar软件找到四种病毒的保守序列,再利用Primer Premier 5软件针对四种病毒的保守序列设计4对特异性引物。2、JEV和YFV病毒滴度测定实验中的JEV和YFV分别为SA-14-14-2和17D减毒活疫苗株,经BHK21细胞培养,80%病变时收获。将病毒液倍比稀释后96孔板培养,然后采用Reed-Muench法计算TCID50。3、pWNV-prM、pSLEV-CprM体外转录及RNA拷贝数的计算先将质粒单酶切使DNA线性后,按试剂盒说明操作进行体外转录,然后检测RNA质量及测定浓度,最后计算拷贝数。4、四种病毒单重RT-PCR方法的建立将四种虫媒病毒反转录得到cDNA,以cDNA为模板进行PCR检测,PCR特异性检测:单一引物检测混合模板和混合引物检测单一模板;PCR的灵敏度的检测:JEV、YFV的病毒液倍比稀释后每个稀释度分别提取RNA后RT-PCR检测和WNV、SLEV的重组质粒体外转录后的RNA加入正常细胞液中提取RNA后RT-PCR检测。5、M-RT-PCR方法的初步建立和条件优化分别选择四种病毒的一个适当稀释度作为模板,等量混合,四种引物等量混合,RT-PCR反应条件和体系与单重RT-PCR反应相同。根据电泳结果,主要对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化。实验结果1、设计引物经过序列比对验证了引物具有良好的代表性,引物扩增的序列与其它毒株的同源性都很高,基本保证了引物设计的可行性。JEV、YFV、WNV和SLEV的引物分别为JS3-1F:AGAGCGGGGAAAAAGGTCAT,JS3-1R:TTTCACGCTCTTTCTACAGT,YFE-4F:CTTACAGCGGCAATCAA,YFE-4R:AGGCAGAGCCAAACACC,WNM-1F:AGGTGATGATGACGGTAAAT,WNM-1R:AAGCAATAGCACGACAAACA,SLCM-1F:TAGCCATCCTGACATTCTTC,SLCM-1R:CTGTGTGTTGTTGCTGCCTA。扩增的片段大小分别为162bp、307bp、455bp和674bp。2、病毒滴度测定及RNA拷贝数计算结果经统计分析和公式计算,JEV和YFV的病毒滴度分别为1.6×106PFU/ml和4.4×105PFU/ml;经紫外分光光度计测量体外转录后RNA的浓度和计算RNA分子量后得出pWNV-prM-RNA的拷贝数为2.10×1015/ml,pSLEV-CprM-RNA的拷贝数为6.22×1015/ml。3、四种病毒单重RT-PCR扩增反应经实验验证引物具有良好的特异性,JEV和YFV的RT-PCR最低检测病毒滴度分别为128PFU/ml和35PFU/ml,pWNV-prM-RNA和pSLEV-CprM-RNA的RT-PCR最低检测拷贝数分别为2.10×103/ml和3.11×104/ml。4、M-RT-PCR的初步建立及条件优化经条件的优化,M-RT-PCR最佳条件如下:引物浓度:JEV和SLEV的引物浓度0.5μM,YFV和WNV的引物浓度在1μM;退火温度:49.4℃;Mg2+浓度:3mM;dNTP浓度为:250μM。结论1、设计了可以用于多重检测JEV、YFV、WNV和SLEV的4对特异性引物;2、建立了JEV、YFV、WNV和SLEV的单重RT-PCR检测方法,能够快速敏感的检测出这四种病毒;3、利用体外转录技术制备了WNV和SLEV达到毫克级的RNA;4、初步建立了鉴别JEV、YFV、WNV和SLEV的M-RT-PCR检测方法。