抗展青霉素单链抗体的制备及鉴定

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展青霉素是由曲霉属、青霉属等多种真菌产生的内酯次级代谢产物,在霉烂的山楂、苹果、葡萄、番茄等水果,以及过期的火腿、糕点等食品中均有存在。展青霉素对动物的细胞和组织具有致畸、致癌、致突变性,人摄入展青霉素后会产生呕吐、胃痉挛等反应。鉴于展青霉素在水果等食品中的广泛存在以及对食用者的毒性作用,使得预防和控制展青霉素的污染成为全球高度关注的重要问题,而对该毒素的快速准确的检测则成为控制其污染扩散的有效手段。为开发基于抗体的快速免疫学检测方法,本试验在前人研究基础上,利用混合酸酐联合活泼酯法,成功的制备了免疫原PAT-BSA和包被原PAT-OVA。采用常规免疫和足垫免疫两种方法,免疫BALB/c小鼠。将免疫后抗体血清效价达到1:4000以上的BALB/c小鼠脾细胞,一方面利用杂交瘤技术筛选单克隆抗体,另一方面,提取脾细胞RNA,反转录获得全套cDNA基因,以此为模板,PCR方法获得VH和VL基因,SOE-PCR方法组装得到单链抗体基因19T-ScFv-7,该基因全长759bp,含有378bp轻链可变区基因,399bp重链可变区基因,15bp Linker(Gly4Ser)3基因,经过IgBlast分析,具有抗体可变区典型结构域,利用原核表达系统对单链抗体的基因进行了有效表达,表达蛋白的分子量为29kDa,利用ELISA方法并对表达产物的生物学活性进行鉴定,可与展青霉素结合;与此同时,利用噬菌体展示技术构建抗展青霉素单链抗体库,并对其进行初步淘选,经过3轮淘筛,并利用ELISA测定其活性,获得阳性结合菌株,对表达蛋白初步纯化。为进一步开发基于单链抗体的免疫学检测方法奠定实验基础。
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