趋化因子CCL11是CC趋化因子家族的成员,具有驱动免疫细胞迁移的功能;趋化因子受体CCR3是G蛋白偶联受体A家族中的重要成员,位于免疫细胞膜的表面。配体CCL11与受体CCR3的特异位点结合能够控制免疫细胞穿过血管壁迁移到炎症部位或者淋巴器官中,在过敏性炎症和哮喘等疾病中发挥着重要作用,是一个重要的药物靶点。通过与配体CCL11竞争性结合CCR3来阻断信号转导途径有望治愈相关疾病。目前趋化因子CCL11虽然结构相对简单、分子量较小,但其结构稳定性和折叠过程还没有被系统的研究。此外,趋化因子受体CCR3的晶体结构也一直未见报道。在本论文中,一方面,使用基因定点突变和Stopped flow技术对CCL11热力学稳定性和折叠机理进行了系统的研究。另一方面,使用高通量结晶技术对CCR3和CCL11形成的复合体进行了结晶条件筛选。具体内容如下:在热力学稳定性和折叠机理部分,首先,设计了趋化因子CCL11去除一对二硫键的两个突变体。化学滴定结果显示,野生型CCL11在盐酸胍浓度为4.50 mol/L时蛋白完全变性,对平衡滴定曲线分析得到化学变性中点(D50)为2.20 mol/L,吉布斯自由能变化(ΔG)为3.39 kcal.mol-1。两个突变体CCL11在整个平衡滴定过程中一直以变性态存在且CD光谱没有明显的二级结构特征,说明在CCL11结构中每对二硫键对于维持结构的稳定性有着重要的作用。其次,野生型趋化因子CCL11温度变性结果显示,趋化因子CCL11高温变性后没有复性能力,对温度变性曲线分析得到温度变性中点(Tm)为325.1K。最后,趋化因子CCL11的去折叠动力学研究显示,在酸胍浓度为0-3.5M范围内,趋化因子CCL11去折叠过程中包含一个折叠路径内的中间态,且趋化因子CCL11去折叠过程符合三态模型即天然态(N)转变成折叠中间态(I)再转变成去折叠态(U)。当盐酸胍浓度为3.5-7M范围时,折叠中间态消失,该过程蛋白的去折叠方式符合两态模型即天然态(N)转变成去折叠态(U)。在趋化因子受体CCR3制备和结晶条件筛选部分,首先,使用实验室先前使用的pMAL-p4x载体表达融合蛋白MBP-CCR3的表达并对其与CCL11的结合活性进行了验证,结果显示MBP-CCR3融合蛋白具有较高的表达量(2mg/L),但MBP-CCR3融合蛋白与CCL11结合活性非常低不能有效形成复合物。因此我们另外设计了带有SUMO3,GST两种不同融合标签的表达载体继续进行相关条件的探索。结果发现:SUMO3-CCR3融合蛋白表达量非常低(0.5mg/L)而GST-CCR3融合蛋白表达量较高(1.5mg/L)。但GST-CCR3融合蛋白主要以多聚体的形式聚集在细胞膜上且多聚体不具有结合生物活性。其次,还使用实验室保存的HEK293表达体系进行野生型CCR3表达,结果显示:野生型CCR3在哺乳动物细胞中表达量在毫克级水平,存在着二聚体和单体形式,能与CCL11形成较稳定的复合物。最后,使用高通量结晶技术对CCR3与CCL11复合物以及单独的CCL11进行了筛选。但野生型CCR3和CCL11形成复合物来进行高通量结晶条件筛选的方式未能获得晶体,而单独配体CCL11有晶体产生,其结晶条件为30%v/v polyethytene glycol 400,0.1M sodium acetate,0.2M calcium acetate,pH=4.5。