蔗糖磷酸化酶（Sucrose phosphorylase,SPase,EC 2.4.1.7）属于糖基转移酶,由于其广泛的底物特异性,应用在食品、化妆品、医药工业等各个领域。α-熊果苷是对苯二酚的糖基化产物,是一种安全有效的美白添加剂。SPase催化合成α-熊果苷具有绿色高效、条件温和的优势。然而野生型菌株的SPase产量较低,不能满足工业应用的要求。利用基因工程策略提高SPase的可溶性表达水平以及蛋白质工程策略提高SPase的催化活力迫在眉睫。本论文通过分子伴侣基因共表达策略提高Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum来源SPase（TtSPase）的可溶性表达量,优化了合成α-熊果苷的催化工艺。并且通过对关键位点进行分子改造,提高TtSPase催化活性。主要研究内容如下:（1）构建重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b（+）/spase,实现了Tt SPase在大肠杆菌中的异源表达,并对其发酵条件进行优化。最终TtSPase的比活力达到3.83 U·mg^-1。对TtSPase的酶学性质进一步研究。结果显示,TtSPase的最适反应pH为6.5,最适反应温度是60°C,在70°C和80°C条件下的半衰期t_1/2分别为19 min和2.3 min,T₅₀³⁰为67°C,解链温度Tm值也高达73°C左右。TtSPase的动力学参数K_m和k_cat/K_m分别为55.6 mM和1.8 s^-1·mM^-1。（2）分别构建TtSPase与四种不同的分子伴侣（pKJE7、pG-KJE8、pGro7和pG-TF2）共表达菌株,并对其表达条件（诱导剂浓度、诱导剂添加顺序、诱导温度）进行优化。结果显示,TtSPase单独表达时可溶性表达量约为10%,而pG-KJE8-SPase、pG-TF2-SPase共表达菌株的SPase可溶性则达到了约40%和85%,比活力分别达到18.5U·mg^–1和25.7 U·mg^–1,是单独表达TtSPase比活力的4.85和6.22倍。结果表明,GroES-GroEL对TtSPase的表达有积极影响,且DnaK-DnaJ-GrpE和TF能与GroES-GroEL相互协作,共同帮助新生肽链正确折叠,防止蛋白聚集,减少包涵体的形成。（3）优化了TtSPase催化合成α-熊果苷工艺条件。结果表明,在1.5 mL、pH 6.6的反应体系中,加入终浓度为400 mM的蔗糖、100 mM的对苯二酚和50 U的Tt SPase,在25°C条件下避光反应16 h,α-熊果苷达到最大产量,最高摩尔产率为22.1%。（4）为提高TtSPase的催化活力进而提高α-熊果苷的产量,本文通过同源建模和分子对接得到了酶与底物的复合晶体结构,探究Tt SPase与底物相互作用的关键氨基酸。通过定向进化和随机突变将关键氨基酸突变成其它不同类型氨基酸。结果发现V239A和Y201L的比活力是WT的1.3和1.2倍,分别是494 U·mg^–1和454 U·mg^–1。