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本文主要从以下几个部分展开论述: 第一部分:长链非编码RNA-ATB在HCV相关肝纤维化患者血浆及肝组织的表达变化 目的: 明确lncRNA-ATB在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)相关肝纤维化患者血浆及肝组织的表达变化,分析血浆lncRNA-ATB作为生物学标记对HCV相关肝纤维化的诊断价值。 方法: 采用随机对照研究,选择2014年9月至2015年6月在河北医科大学第三医院门诊及住院的慢性HCV感染者36例,并选择15例健康体检者作为健康对照。留取外周静脉血,分别分离血浆、血清,储存于-80℃冰箱备用。HCV感染患者均进行肝穿刺活检术及肝组织病理检查,根据METAVIR评分系统将HCV患者分为轻度纤维化组(F<2;n=14)和中至重度纤维化组(2≤F<4; n=22)。另选5例肝移植供体作为健康对照组。血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平采用酶法检测;肝组织切片行苏木素-伊红(Haematoxylin and eosin,HE)染色及Masson三色染色,观察肝组织脂肪变性、炎症及纤维化程度;免疫组织化学染色方法评估肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原α1(alpha-1 typeⅠ collagen,Col1A1)表达;原位杂交方法检测肝组织lncRNA-ATB表达;采用Trizol LS提取血浆总RNA,以实时荧光定量PCR方法检测血浆lncRNA-ATB表达。 结果: 1.患者一般情况:健康对照组(n=15),其中男性8例(53.3%),女性7例(46.7%),平均年龄(51.2±11.4)岁;HCV感染患者F<2组(n=14),其中男性6例(42.9%),女性8例(57.1%),平均年龄(48.8±11.6)岁;HCV感染患者2≤F<4组(n=22),其中男性12例(54.5%),女性10例(45.5%),平均年龄(52.5±7.2)岁。三组年龄之间差异无统计学意义(F=0.596,p=0.555)。 2.血清ALT、AST水平:健康对照组、HCV感染患者F<2组及HCV感染患者2≤F<4组血清ALT中位数分别为17.0、33.0、50.0 U/L,三组之间差异具有统计学意义(x2=23.79,p=0.000);血清AST中位数分别为15.0、32.0、43.5U/L,三组之间差异具有统计学意义(x2=23.33,p=0.000)。 结论: 1.肝组织病理学显示HCV感染患者肝脏炎症及纤维化增加,伴随lncRNA-ATB表达上调。 2.血浆lncRNA-ATB表达在HCV感染患者中显著升高,并在中至重度肝纤维化患者中进一步升高。并且血浆lncRNA-ATB水平与HCV相关肝纤维化分期呈正相关。 3.血浆lncRNA-ATB对HCV相关肝纤维化程度具有重要的诊断价值,有望成为诊断HCV相关肝纤维化的新型生物学标记。 第二部分: 长链非编码RNA-ATB在体外活化的肝星状细胞中的表达变化 目的: 建立稳定表达HCV核心蛋白的HepG2-CORE细胞系,探明lncRNA-ATB在HSC活化中的作用。 方法: 转染pcDNA3.1-HCV核心蛋白质粒至HepG2细胞,筛选稳定表达HCV核心蛋白的HepG2-CORE细胞系并进行验证;进一步应用小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)转染HepG2-CORE细胞以敲除转化生长因子(transforming growth factor,TGFβ)1。实时荧光定量PCR和Western blot方法检测HCV core表达;酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清液中TGFβ1水平。将细胞培养上清作为条件培养基处理人肝星状细胞系LX-2,同时应用重组人TGFβ1按剂量梯度及时间梯度处理LX-2细胞。实时荧光定量PCR、Western blot及免疫细胞荧光染色方法检测α-SMA、Col1A1表达;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting Kit-8,CCK-8)检测细胞增殖情况;实时荧光定量PCR检测lncRNA-ATB表达变化。 结果: 1.稳定表达HCV核心蛋白的HepG2-CORE细胞系建立成功:HepG2-CORE细胞与对照HepG2-NC细胞相比,能够稳定表达HCV coremRNA和蛋白;培养上清液中TGFβ1水平显著升高。si-TGFβ1-1能明显减少HepG2-CORE细胞TGFβ1 mRNA表达,并降低细胞培养上清中TGFβ1水平。 2.HepG2-CORE细胞培养上清作为条件培养基促进HSC活化:HepG2-CORE细胞培养上清液促进LX-2细胞α-SMA、Col1A1 mRNA及蛋白表达显著增加,与之相比,si-TGFβ1-1转染后的HepG2-CORE细胞培养上清液引起LX-2细胞α-SMA、Col1A1 mRNA及蛋白表达程度下降。 结论: 1.稳定表达HCV核心蛋白的HepG2-CORE细胞上清液可作为条件培养基促进LX-2细胞活化; 2.敲除HepG2-CORE细胞中TGFβ1表达,减少细胞培养上清液中TGFβ1水平,并减少LX-2细胞活化; 3.重组人TGFβ1以剂量及时间依赖方式促进细胞活化及增殖; 4.LncRNA-ATB可能为HSC活化的重要分子标志。 第三部分:长链非编码RNA-ATB的竞争性内源RNA分子调控机制预测及验证 目的: 预测并验证lncRNA-ATB作为竞争性内源RNA调控相关miRNA靶基因的分子机制。 方法: 采用分子生物信息学分析预测lncRNA-ATB相关miRNA及其靶基因,构建lncRNA-ATB及靶基因3-非翻译区(untranslated regions,UTR)野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,与miRNA模拟物(mimics)共转染,定量检测双荧光素酶催化产生的荧光数值,验证miRNA的作用靶点。应用miRNA mimics、抑制剂(inhibitor)以及相应对照转染LX-2细胞,48h后收集细胞,采用实时荧光定量PCR检测lncRNA-ATB、miRNA及α-SMA、Col1A1 mRNA表达变化;Western blot方法检测α-SMA、Col1A1蛋白表达变化。 结果: 1.分子生物信息学预测lncRNA-ATB相关的miRNA及其靶基因:lncRNA-ATB与Ⅱ型TGF-β受体(TGF-β typeⅡ receptor,TGF-βRⅡ)和SMAD2具有相同的miRNA-425-5p结合位点(CACAGUA)。 2.双荧光素酶报告基因验证miRNA-425-5p与lncRNA-ATB及靶基因结合:结果显示miRNA-425-5p mimics可显著下调psi-ATB-wt、psi-TGF-βRⅡ-wt、psi-SMAD2-wt依赖的荧光素酶活性。 结论: 1.生物信息学预测及双荧光素酶报告基因检测证实lncRNA-ATB与TGF-βRⅡ和SMAD2具有相同的miR-425-5p结合位点。 2.靶向调控miR-425-5p表达引起LX-2细胞内源性miR-425-5p表达变化,并能通过转录抑制TGF-βRⅡ、SMAD2蛋白表达及调节α-SMA、Col1A1 mRNA及蛋白表达变化。 第四部分:靶向调控长链非编码RNA-ATB对肝星状细胞活化的作用及分子机制 目的: 明确过表达及敲除lncRNA-ATB对HSC活化的影响及潜在的分子生物学机制。 方法: 构建lncRNA-ATB过表达质粒转染LX-2细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blot方法检测α-SMA、Col1A1、TGF-βRⅡ和SMAD2表达;LX-2细胞增殖通过CCK-8试剂盒检测;免疫荧光细胞化学染色检测TGF-βRⅡ和SMAD2表达;实时荧光定量PCR检测lncRNA-ATB、miR-425-5p表达变化。 结果: LncRNA-ATB促进LX-2细胞活化:过表达lncRNA-ATB可增加LX-2细胞α-SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表达,并促进LX-2细胞增殖。 结论: 1.过表达lncRNA-ATB可通过降低内源性miR-425-5p上调TGF-βRⅡ和SMAD2表达,促进肝星状细胞活化及增殖。 2.敲除lncRNA-ATB可增加miR-425-5p而下调TGF-βRⅡ和SMAD2表达,抑制肝星状细胞活化及增殖。