抗体可被称为一种天然免疫佐剂,特异性抗体和抗原在合适比例下形成的免疫原性复合物,通过Fc段与免疫效应细胞的相互作用,可改变和增强抗原递呈细胞(APC)对抗原的摄取、加工和递呈,增强诱生的免疫应答反应,起到对抗原诱生免疫应答的调节作用。本室曾在多种乙型肝炎模式动物中发现按一定比例构建的乙肝表面抗原抗体复合物(HBsAg-antigen-antibody Immune Complexes,简称IC)免疫可以部分逆转免疫耐受。在此基础上,本室首先提出并研制了重组酵母菌表达乙肝表面抗原HBsAg-人抗HBs免疫球蛋白复合物型治疗性疫苗(YIC),在慢性乙肝患者先期临床研究中,初步结果显示复合物有免疫原性,YIC免疫对部分患者有一定的抗病毒疗效。以往对于IC诱生免疫应答的机理表明,IC通过抗体Fc片段促进小鼠巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞摄取抗原、有效递呈并激活T细胞,产生较高水平的细胞因子。YIC在体外促进慢性乙肝患者的树突状细胞表达B7和CD40等共刺激分子,成熟的树突状细胞通过分泌IL-12等细胞因子更有效地诱导T细胞活化。　　 为进一步全面了解IC调节DC功能的分子机制,并探讨扩大IC的应用,本课题第一部分用基因芯片技术检测了HBV转基因小鼠与正常小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)的基因表达水平,并检测了IC或HBsAg作用后转基因小鼠DC的基因表达水平。根据芯片结果,用生物信息学手段对其中免疫相关基因的表达差异变化进行了深入分析。结果发现与正常小鼠比较,转基因小鼠DC的诸多免疫相关基因转录水平发生了变化,表达上调的基因多和自身免疫功能相关,提示HBV转基因小鼠可能存在体液及补体免疫功能紊乱。另一方面,下调的基因提示转基因小鼠在抗原递呈,干扰素应答,细胞和抗病毒天然免疫应答等功能可能有下降的趋势。转基因小鼠DC的这些基因表达变化为进一步研究慢性乙肝携带者的DC功能提供了一些线索。　　 有趣的是,HBV转基因小鼠DC在与IC或HBsAg相互作用48小时后,发现部分上述与正常小鼠比较异常表达的基因发生了逆向表达变化。如在转基因小鼠DC表现为下调的基因TAP1,H2-Q1,Ifi2O3,Lilrb4,Cxcl1、2等出现了上调。而在转基因小鼠DC表现为上调的基因Igk-C,Clqa、b、c,Prg2等出现了下调。另外,IC或HBsAg的负载都可以使转基因小鼠DC的干扰素作用相关基因IRF7,OAS2和OASL,等表达上调。这些数据提示转基因小鼠DC经过IC或HBsAg负载后,可以促使一些异常表达的免疫相关功能基因恢复表达接近正常水平,帮助增强DC调节免疫应答的功能。　　 HBV转基因小鼠DC与IC作用后,与HBsAg作用后的转基因小鼠DC免疫相关基因表达谱比较,发现有6个基因上调。其中定量PCR结果上调倍数最高的是FcyRIIB(IgG Fc gammar rgceptorⅡB)受体基因。IC主要通过抗体Fc段促进抗原递呈细胞摄取抗原,因此DCFcyR受体基因发生明显的表达变化也在情理之中。基因芯片的结果为我们进一步研究IC对DC的全面作用提供了线索。　　 由于发现HBV转基因小鼠DC与IC作用后FcyR受体基因上调。本课题第二部分研究了YIC对FcyR受体蛋白的调节作用。首先比较了FcyR系列受体在部分慢性乙肝患者和健康正常人新鲜外周血单个核细胞(PBMC)表面的表达情况。结果显示慢性乙肝患者FcyRⅡ类受体阳性PBMC显著高于正常人(P<0.05),FcγRⅢ类受体阳性PBMC显著低于正常人(P<0.05)。在获得了FeyRⅡB受体特异性抗体后,研究了其中部分标本的FcγRⅡB受体表达情况。结果显示慢性乙肝患者FcγRⅡB受体阳性PBMCs高于正常人,但由于样本数少统计没有显著性差异(P=0.09)。　　 YIC通过Fc作用而发挥治疗作用,因此进一步研究了部分60,90μgYIC免疫临床试验患者PBMC的FcγR受体动态表达。结果显示YIC免疫患者PBMCs中FcyRⅡ受体阳性细胞数在免疫期间12w和24w升高(P<0.05),随访期44w恢复。进一步研究显示是FcγRⅡB受体升高(P<0.05)而FcγRⅡA类受体没有类似变化。安慰剂免疫患者FcγRⅡB和FcγRⅡA受体均没有发生显著变化。FcγRⅡB是一类抑制性受体,主要通过自身分子胞浆区的免疫受体酪氨酸抑制基序ITIM传导信号。然而也有研究表明没有抑制性受体FcγRⅡB表达的小鼠DC摄取免疫复合物和刺激T细胞的能力明显降低。目前抑制性受体FcγRⅡB对于DC在摄取免疫复合物以后的免疫应答调节作用仍有不同观点。因此推测IC作用转基因小鼠DC和部分YIC免疫患者PBMCsFcγRⅡB受体表达升高的原因是FcyR类受体在促进IC摄取和递呈的同时,调节增强避免过度免疫应答和自身免疫病发生。深入研究将有助于揭示IC和FcγR类受体相互作用的过程与机理,并为选择适宜患者,调节免疫应答提供理论基础。　　 DC摄取抗原后加工递呈并激活T细胞,活化的T细胞通过杀伤细胞和病毒特异性细胞因子介导抗病毒免疫应答。为了研究与观察YIC免疫对DC-T细胞的调节作用,本课题第三部分观察了经YIC治疗患者的T细胞应答。对比研究了ⅥC免疫良好应答患者和无应答患者的抗病毒免疫反应和Th1/2类特异性细胞因子表达。在经60μgYIC治疗患者中,5名应答患者中有4名患者24周PBMCs在HBsAg刺激下显示IFN-γ,TNF-α和/或IL-2,IL-4,IL-5和IL-10水平升高。5名YIC无应答患者中2名细胞因子诱生不明显且细胞因子种类较窄,因此不能有效地抑制病毒复制或使e抗原转阴。这些结果显示YIC免疫可以诱导部分慢-性乙肝患者产生HBsAg特异性细胞因子,但细胞因子持续时间短暂,在随访6个月中己消失,提示细胞免疫比细胞因子有更重要的作用。由于细胞免疫在治疗慢性乙肝患者中的重要作用,同时也分析了患者转氨酶变化和溶细胞性免疫应答的相关性。结果显示大部分YIC免疫应答患者免疫期间出现ALT—过性升高同时伴有血清HBVDNA降低。表明溶细胞性免疫反应和病毒特异性细胞因子共同参与了YIC的免疫应答效应。　　 本研究的另一目的是探索抗原-抗体复合物类疫苗的应用新途径。鼻腔和呼吸道黏膜有多种免疫效应细胞表达FcγR受体,设想在黏膜免疫中抗原抗体复合物也可以增强免疫应答效应。本课题第四部分用流感病毒裂解疫苗(H3N2)作为免疫原,组建流感病毒血凝素抗原抗体复合物,比较了其与H3N2联合多种佐剂诱导的小鼠体液和细胞免疫应答,进一步探讨了抗原抗体复合物在黏膜免疫中的效应。结果显示,抗原抗体复合物滴鼻免疫诱生的血清IgG抗体和血凝抑制抗体及局部抗-H3N2IgA效价明显高于单独裂解疫苗的免疫反应。而IFN-γ的反应与H3N2免疫组无明显差异,这一结果与我们乙肝表面抗原抗体复合物在小鼠和人Ⅰ期临床实验的研究结果有所不同。其原因可能因为两者的抗原结构不同,HBsAg是完整的颗粒结构,而本次实验使用的是裂解纯化的血凝素单位抗原。进一步对比研究流感灭活全病毒和裂解病毒的免疫反应将可阐明这一系列的原因。由于条件所限,本研究中,我们未能做攻毒实验,但是流感血凝抑制实验(HAI)检测用IC作鼻黏膜免疫也可能是一种新的免疫技术。