【研究背景】PBK/TOPK是新发现的一种丝苏氨酸激酶,最初发现能够与PDZ结构域结合,文献报道它能与抑癌基因hDlg、P53蛋白、raf蛋白等多个分子结合相互作用,能激活p38MAPK、Erk、JNK等多个下游分子,作为蛋白激酶分子参与信号转导通路。既往研究表明在PBK/TOPK在除睾丸组织外的正常组织中表达量均较低,而在几种肿瘤中表达升高,从而引起大家的关注。然而文献从mRNA上分析了PBK/TOPK的组织分布,所涉及的肿瘤类型也很有限,况且在人胆管细胞癌组织的表达、临床意义及其生物学功能也未见报道。目前为止蛋白水平上PBK/TOPK在正常组织及常见肿瘤的组织分布尚未见报道。【目的】1.研究PBK/TOPK在人体正常组织和常见恶性肿瘤组织的表达,探讨其作为肿瘤标志物的可能性;2.组织芯片结果显示,肝脏中PBK/TOPK仅在正常胆管细胞和胆管癌细胞中呈特异表达,因此探讨在胆管癌手术标本的表达和与患者预后的关系;3.PBK/TOPK在胆管癌细胞系中的表达及其功能初步研究。【方法】1.应用免疫组织化学EnVision法,分别在含有人体19种正常组织和含有19种恶性肿瘤组织的组织芯片上进行PBK/ TOPK染色,检测PBK/TOPK蛋白的表达;2.应用EnVision法研究PBK/TOPK在74例胆管癌(包括57例手术标本和17例肝脏穿刺标本),33例肝细胞肝癌和10例正常肝脏标本的表达,并与胆管细胞标志物CK7和CK19进行比较,并用Ki67染色分析PBK/TOPK与细胞增殖的关系;3.对57例胆管癌手术患者进行生存期随访,其中24例获得随访结果,用Kaplan–Meier方法做生存曲线,并分析PBK/TOPK的表达与患者生存期之间的关系; 4.采用RT-PCR及Western Blot方法检测胆管细胞癌细胞系QBC939细胞中的PBK/TOPK分子的表达,并测序构建PBK/TOPK真核表达载体;5.用EGF刺激胆管癌细胞,从蛋白和mRNA水平检测PBK/TOPK表达的变化;并观察其过表达对细胞周期的影响;6.用siRNA抑制胆管癌细胞PBK/TOPK的表达,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化;7.利用免疫组织化学方法,检测CD133在胆管癌中的表达,并用胆管癌细胞系研究其功能。【结果】结果1.在19种正常组织中,只有头皮的汗腺、睾丸的精原细胞、肝脏的胆管上皮、食管黏膜下腺体、胰腺外分泌部的导管上皮、前列腺的基底细胞和肾脏的远曲小管8种组织有不同数量细胞明确阳性表达;在19种人类常见恶性肿瘤组织中,乳腺癌、子宫颈癌、甲状腺癌等多种肿瘤组织中存在PBK/TOPK的大量、强阳性表达;2. PBK/TOPK在正常胆管中明确表达,但肝细胞为阴性,肝硬化组织中的反应性增生小胆管的表达明显增强,阳性部位在胆管细胞的胞浆中;在74例胆管癌中,68例中可见PBK/TOPK的阳性表达。而33例肝细胞肝癌均为阴性,统计学分析,两者间具有非常显著的差异(P<0.001)。PBK/TOPK染色和Ki67染色无明确的相关关系。此外,PBK/TOPK与CK7或CK19相比在鉴别肝细胞肝癌上更加特异。3.在57例手术切除的胆管癌患者中,有24例获得随访资料,利用Kaplan-Meier曲线分析表明,13例PBK/TOPK低表达患者的中位生存期为8个月,而高表达患者的中位生存期为14个月,两组中位生存时间有明显差异(P=0.013)。同时发现,高分化胆管癌的中位生存时间和低分化胆管癌也有统计学差异(P=0.011)。提示PBK/TOPK可以作为评价胆管细胞癌患者预后的一个指标。4.在胆管癌细胞系QBC939细胞中,检测到了PBK/TOPK的mRNA和蛋白;经测序比对发现mRNA与GenBank中PBK/TOPK基因符合率为100%,并成功构建真核表达载体;5. RNAi抑制PBK/TOPK表达后,经流式细胞仪分析表明,对细胞的周期无明显影响;6.经EGF刺激后,发现胆管癌细胞系中PBK/TOPKmRNA和蛋白水平均增加,不影响处于G1期细胞数,却使S期细胞增加, G2/M期细胞总数减少。【结论】1、首次系统研究了PBK/TOPK蛋白在人类正常组织和常见恶性肿瘤组织的表达,发现8种正常组织表达,在乳腺癌、甲状腺癌及子宫颈癌等多种恶性肿瘤组织中表达增加;2、发现PBK/TOPK在所有标本正常胆管上皮细胞和大部分胆管癌标本中表达,而正常肝细胞和肝细胞肝癌不表达,提示PBK/TOPK有助于肝内胆管癌和肝细胞肝癌的鉴别诊断;3、PBK/TOPK的表达与胆管癌患者的预后密切相关;4、在胆管癌细胞系中,EGF刺激可使PBK/TOPK的表达上调,并影响细胞周期中从S期到G2/M的进程,但是抑制PBK/TOPK表达不影响细胞周期;5、成功构建了PBK/TOPK的真核表达载体,为下一步研究PBK/TOPK的功能奠定了基础。