鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是发生于鼻咽部黏膜的恶性肿瘤。普遍认为,鼻咽癌的发生发展是基因-环境-EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染交互作用的多病因、多步骤过程。在鼻咽癌高发区几乎100%的鼻咽癌患者肿瘤组织为EBV阳性。EBV编码基因在患者所有NPC细胞中持续表达,主要为II型潜伏状态,表达三种潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2A、LMP2B)、EBV核抗原1(EBNA1)和EBV编码的小RNAs(EBERs)。这些病毒产物使肿瘤具有更恶性的生物学行为。在转录水平,鼻咽癌中LMP2A的检出率高达90%。我们前期研究发现,表达LMP2A的鼻咽癌细胞迁移和侵袭的能力增强,并与细胞整合素ITGβ4的定位聚集化改变相关。而ITGβ4定位的改变可能导致其参与形成的半桥粒结构瓦解,从而有利于细胞的迁移。本研究探索并证实LMP2A表达诱导的ITGβ4定位改变的分子机制,以期从新的角度阐明LMP2A促进鼻咽癌细胞转移的分子机理。首先,我们成功构建了稳定表达LMP2A的鼻咽癌细胞系CNE1和TW03。将荧光标记的钙离子指示剂用于检测细胞内钙离子的相对量,发现当LMP2A阳性表达时,CNE1和TW03内有更高的钙离子含量。为了探讨细胞内钙离子在细胞迁移中的作用,我们用钙离子螯合剂BAPTA-AM阻断胞内游离的钙离子,发现LMP2A-CNE1、LMP2A-TW03的迁移能力有明显减弱,提示LMP2A可能依赖增加细胞内钙离子从而促进鼻咽癌细胞的迁移。其次,为探究lmp2a如何影响细胞内钙离子,我们分析了lmp2a表达和egfr表达及其磷酸化的关系,发现lmp2a-cne1和lmp2a-tw03中egfr磷酸化水平高于对照细胞。利用免疫荧光染色法观察到egfr的表达定位发生聚集改变。利用egf处理细胞激活egfr通路可增加细胞内钙离子聚集。这些结果表明鼻咽癌细胞中lmp2a的表达可激活egfr通路。再次,为探讨lmp2a通过调控钙离子进而影响细胞转移能力的下游分子路径,我们通过钙蛋白酶活性检测试剂盒检测了依赖钙离子激活的钙蛋白酶capns。与细胞内钙离子水平数据一致,在lmp2a-cne1和lmp2a-tw03具有更高的钙蛋白酶活性,差异具有统计学意义。这提示鼻咽癌细胞中lmp2a的表达通过激活egfr,增加胞内钙离子并以此激活钙蛋白酶。为了阐明钙蛋白酶活性对鼻咽癌细胞移行能力的影响,我们利用钙蛋白酶抑制剂sja6017处理细胞,划痕实验结果表明,sja6017可抑制lmp2a阳性表达鼻咽癌细胞的运动,并呈剂量依赖性。这提示鼻咽癌细胞中lmp2a的表达依赖激活egfr/钙离子/钙蛋白酶路径促进细胞迁移。最后,为了阐明钙蛋白酶capns介导itgβ4蛋白剪切与细胞移动能力的关联,我们用激光共聚焦显微镜分析了tw03和lmp2a-tw03中itgβ4的定位分布,发现tw03细胞中itgβ4均匀分布在细胞底层,而lmp2a-tw03细胞中itgβ4则聚集在细胞伪足处。为了验证lmp2a-tw03细胞中itgβ4分布改变与钙蛋白酶活性密切相关,我们进一步用钙蛋白酶抑制剂sja6017处理lmp2a-tw03细胞,itgβ4的表达定位恢复到均匀分布在细胞底层的状态,类似tw03细胞。此外,我们还通过westernblot发现itgβ4(205kd)可被激活的钙蛋白酶剪切成(165kda和125kda)两种亚型。在lmp2a阳性表达的cne1和tw03中,itgβ4的剪切显著高于对照细胞系,而sja6017可抑制itgβ4剪切的发生。提示itgβ4的蛋白激酶依赖剪切可能与其在细胞表达定位改变有关,并以此促进细胞的迁移。综上所述,EBV编码的LMP2A可能通过激活EGFR,促进钙离子含量增多,激活CAPNs活性,从而剪切ITGβ4并促进ITGβ4膜定位改变,以此促进鼻咽癌细胞的转移。由此,我们发现了一个新的促进鼻咽癌细胞迁移的分子机制。我们的数据揭示了LMP2A调控的转移相关的分子可能成为抑制鼻咽癌肿瘤细胞转移的药物靶点,对鼻咽癌的治疗具有深远的意义。