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研究背景及目的急性髓系白血病（acute myeloidleukemia,AML）是一类起源于造血干细胞的克隆性血液系统恶性肿瘤,它源于造血干细胞或祖细胞的基因异常,导致细胞不受控制的生长和增殖,从而抑制正常造血,导致骨髓衰竭,也可浸润肝、脾、淋巴结等各种脏器组织,表现为贫血、出血、感染、浸润和高代谢等征象。目前主要的治疗方式有联合化疗、靶向治疗、免疫治疗、干细胞移植等。近几十年来,经过治疗方案的不断优化,尽管缓解率有所提升,但仍然存在很多挑战。首先,个体对化疗药物的敏感程度不同,药物吸收利用度不同,治愈率不同。第二,化疗药物毒副作用较大,化疗后发生的多种并发症使部分人群不耐受。最后,白血病多药耐药的产生及复发是导致治疗失败的主要原因,也是阻碍患者长期存活的瓶颈。因此,需要寻找新的治疗药物来改善目前的治疗方法。中医药治疗急性白血病有一定的特色和优势,多项研究表明,中药成分作为辅助治疗,能有效逆转化疗药物的耐药性,增强西药化疗的敏感性,降低毒副作用,提高癌症患者的长期生存率。（S）-10-羟基喜树碱（（S）-10-Hydroxycamptothecin,（S）-10-HCPT）是一种从喜树中分离得到的DNA拓扑异构酶Ⅰ（DNA topoisomerase Ⅰ）抑制剂,具有广泛的体外和体内抗癌活性,尤其对实体瘤。对于抗血液系统恶性肿瘤的研究还有很大空白,因此,本课题拟通过体内体外两种研究方式探讨（S）-10-HCPT抗AML的作用机制,为治疗AML提供理论依据及药物参考。研究方法体外研究方法:1.不同浓度（S）-10-HCPT干预5种急性白血病细胞株（MV4-11、THP-1、HL-60、NB-4、Raji）24h,MTT实验检测其抑制作用计算IC50值,其中发现最敏感细胞株为MV4-11、THP-1。随后对MV4-11、THP-1行（S）-10-HCPT24h及48h干预,MTT实验检测其抑制作用,计算抑制率。2.采用流式细胞术、免疫印迹实验（Western Blot,WB）和TUNEL实验检测不同浓度（S）-10-HCPT对THP-1和MV4-11细胞株凋亡的影响。3.采用流式细胞术和WB实验检测不同浓度（S）-10-HCPT对THP-1和MV4-11细胞株周期的影响。4.通过转录组测序技术检测（S）-10-HCPT对THP-1细胞基因表达、KEGG通路富集及GO功能富集的影响。通过RT-PCR和WB实验检测（S）-10-HCPT对MAPK通路相关mRNA、蛋白表达的影响。5.使用 20μM ERK 抑制剂 U0126,10 μM JNK 抑制剂 SP600125,10 μM p38 抑制剂SB203580干预40 nM（S）-10-HCPT预处理的THP-1和MV4-11细胞24h后,用流式细胞术及WB实验检测（S）-10-HCPT是否通过MAPK通路诱导细胞凋亡。体内研究方法:1.构建THP-1细胞BALB/c裸鼠皮下异种移植模型,当瘤体达到100 mm3左右时,随机将裸鼠分为5组:空白组、模型组、阿糖胞苷组（Ara-C）、低剂量（4mg/kg）（S）-10-HCPT组和高剂量（8mg/kg）（S）-10-HCPT组。以腹腔注射方式给药,每隔2天一次,连续14天,观察各组裸鼠皮下移植瘤的生长情况。2.最后一次腹腔注射给药后隔24h将所有裸鼠麻醉后眼眶取血后处死,检测各组裸鼠的外周血象。3.用苏木精—伊红染色法（Hematoxylin and eosin staining,HE staining）检测各组裸鼠肝、脾以及肾组织形态学变化。4.对剥离的瘤体进行WB实验,检测各组裸鼠瘤体组织凋亡蛋白PARP、Cleaved-PARP、Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Bcl-2、Bax 及周期蛋白 CDK4 以及 MAPK信号通路相关蛋白表达的影响。5.对剥离的瘤体进行免疫组织化学实验（Immunohistochemistry,IHC）,检测各组裸鼠瘤体组织中凋亡蛋白Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Bcl-2、Bax和周期蛋白Cyclin D1的表达情况。研究结果体外实验结果1.（S）-10-HCPT抑制急性白血病细胞株增殖,尤其对THP-1和MV4-11细胞株最敏感。对AML细胞株的抑制作用呈现浓度及时间依赖性,随着浓度越高时间越长,抑制作用越强（P＜0.05 或 P＜0.01）。2.（S）-10-HCPT诱导THP-1和MV4-11细胞株凋亡。通过流式细胞术发现随着药物浓度的升高,凋亡率逐渐提高（P＜0.05或P＜0.01）;通过TUNEL实验观察到（S）-10-HCPT可使核内断裂的DNA双链染成红色;通过WB实验观察到随着（S）-10-HCPT浓度的升高,凋亡启动类蛋白剪切体Cleaved-Caspase 8,凋亡效应类关键蛋白剪切体Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP以及促凋亡关键蛋白Bax表达升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达随着（S）-10-HCPT浓度的升高反而下降（P＜0.05或P＜0.01）。3.（S）-10-HCPT阻滞THP-1和MV4-11细胞株周期于G1期。通过流式细胞术观察到,随着（S）-10-HCPT浓度的升高,G1期细胞数量逐渐增多（P＜0.05或P＜0.01）;通过WB实验观察到随着（S）-10-HCPT浓度的升高,Cyclin D1、CDK4表达下降,P21表达提高,（P＜0.05 或 P＜0.01）。4.（S）-10-HCPT激活MAPK通路。通过二代测序观察到,（S）-10-HCPT处理THP-1细胞,KEGG通路主要富集在MAPK;采用RT-PCR、WB实验再次验证,（S）-10-HCPT可以降低MAPK通路的mRNA表达,升高p-ERK、p-JNK、p-p38的蛋白表达（P＜0.05或P＜0.01）。5.（S）-10-HCPT通过MAPK通路诱导THP-1和MV4-11细胞株凋亡。ERK抑制剂U0126,JNK抑制剂SP600125,p38抑制剂SB203580预处理THP-1和MV4-11细胞株后（S）-10-HCPT干预细胞24h,通过流式细胞术实验观察到,ERK抑制剂U0126,JNK抑制剂SP600125,p38抑制剂SB203580降低了（S）-10-HCPT诱导的细胞凋亡率（P＜0.05或P＜0.01）。通过WB实验观察到ERK抑制剂U0126,JNK抑制剂SP600125,p38抑制剂SB203580降低了（S）-10-HCPT诱导的凋亡效应类蛋白剪切体Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP及凋亡启动类蛋白剪切体Cleaved-Caspase 8的蛋白表达,而抗调亡蛋白Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05或P＜0.01）。体内实验结果:1.肿瘤组织的重量和体积随着（S）-10-HCPT治疗浓度的增加而减少,小鼠的总重量也随着（S）-10-HCPT处理浓度的增加而减小。而低剂量（4mg/kg）（S）-10-HCPT组与空白组小鼠总体重无统计学差异。高剂量（8mg/kg）（S）-10-HCPT组和阿糖胞苷组（Cytarabine,Ara-C）小鼠总体重无统计学差异。低剂量（4mg/kg）（S）-10-HCPT组与阿糖胞苷组（4mg/kg）肿瘤组织的重量和体积无统计学差异。高剂量（8mg/kg）（S）-10-HCPT组中肿瘤组织的重量和体积显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。各组裸鼠外周血象的分析结果显示:（S）-10-HCPT在荷瘤小鼠中具有抗肿瘤活性,但在小鼠血液中没有表现出任何明显的毒性迹象（P＜0.05或 P＜0.01）。2.通过对各组裸鼠的肝、脾、肾组织进行HE染色观察,发现各组裸鼠脏器均存在不同程度的病理损伤,而（S）-10-HCPT治疗组裸鼠肝脾肾的损伤与Ara-C治疗组相比均减轻（P＜0.05 或 P＜0.01）。3.瘤体组织的WB实验结果显示:与模型组相比,随着（S）-10-HCPT浓度的升高,凋亡蛋白剪切体Cleaved-Caspase3和促凋亡类蛋白Bax表达上升,抗凋亡的蛋白Bcl-2表达下降,G1期相关蛋白CDK4的表达降低。随着（S）-10-HCPT浓度的升高,p-ERK、p-JNK、p-p38 的表达增加（P＜0.05 或 P＜0.01）。4.瘤体组织的IHC检测结果显示:与模型组相比,随着（S）-10-HCPT浓度的升高,Cleaved-Caspase 3、Bax 的表达增加,Caspase 3、Bcl-2、Cyclin D1 的表达降低。肿瘤组织切片的HE染色显示,与模型组相比,治疗组肿瘤组织细胞消退、形态改变,如细胞增大、细胞核大小变化、核挛缩、核仁边缘模糊等。研究结论1.本研究体外细胞实验验证了（S）-10-HCPT对THP-1和MV4-11细胞株的增殖抑制作用,以及诱导凋亡和周期阻滞;2.通过转录组测序,初步推测（S）-10-HCPT激活MAPK信号通路,通过抑制MAPK通路,发现（S）-10-HCPT通过MAPK信号通路诱导THP-1和MV4-11细胞株的凋亡;3.本研究体内动物实验验证了（S）-10-HCPT对裸鼠皮下瘤的生长抑制作用;（S）-10-HCPT通过MAPK信号通路促进裸鼠皮下瘤的凋亡及周期阻滞;（S）-10-HCPT治疗组裸鼠肝脾肾的损伤与Ara-C治疗组相比均减轻。