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结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一种慢性传染性疾病,一直危害着人类健康。全球有三分之一的人已经感染结核分枝杆菌,有10%的人将可能在以后发展成为结核病。2015年全球新发结核病例有1040万,死于结核病的人数有140万人。近年来,随着新发结核耐药株和HIV/AIDs合并感染病例的增多,导致结核病的发病率增高、全球结核病负担日益加重,尽管从2000年到2015年,结核病引起的死亡率已经下降了 22%,结核病仍然位居引起人类死亡的十大病因之首。目前,卡介苗(BCG)仍然是全球范围内唯一获准广泛使用的用于抵抗结核病的疫苗。BCG是牛结核分枝杆菌经连续传代培养而得到的一种减毒活疫苗。虽然BCG疫苗对预防儿童中栗粒型结核和结核性脑膜炎等有较佳的效果,但BCG对成人结核病的保护率存在有很大差别,在0～80%之间,且BCG只能有效地预防原发性结核病。研究发现不同BCG疫苗株之间随着保护性抗原或者表位的丢失而导致不同的BCG株保护性差异,我们需要研发新的疫苗为更好控制结核病提供新的手段,因此我们需要寻找新的免疫优势抗原或在表位,将其用于研制重组BCG或者用于BCG接种后的加强免疫型新型疫苗。在本研究中,我们结合基因组学和生物信息学技术对H37Rv蛋白质组上的蛋白抗原进行筛选,将筛选出的蛋白抗原进行T细胞表位预测,选取预测中得分值较高的表位,对这些表位多肽进行合成。收集肺结核患者、肺部其他疾病患者和健康志愿者的外周血淋巴细胞,用多肽作为刺激原,进行进行伽马干扰素释放试验(interferon gamma release assay,IGRA),从而筛选出结核分枝杆菌免疫优势抗原或者表位。选取阳性率较高的抗原表位,与佐剂DDA和polyI:C乳化后免疫BALB/c小鼠,检测相应抗原刺激后的脾细胞上清中的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的浓度,同时检测血清中的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度。用流式細胞仪检测CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的比例,对这些表位的免疫原性进行评价。利用seppa2.0对B细胞表位预测,合成表位B细胞表位多肽,并利用肺结核患者和健康志愿者的血清对这些B细胞表位进行血清学评价。另外,本实验制备的重组蛋白Rv2351c,本研究中利用IGRA实验和动物实验对Rv2351c的诊断性能和免疫效果进行了评价。最终,我们共对H37Rv基因组上273个抗原的2726个T细胞表位和B细胞表位进行了预测,从中选取了来自13个抗原的265个人T细胞表位多肽和来自3个抗原的22条人B细胞抗原表位多肽进行合成。我们通过IGRA鉴定出了具有抗原性30个人T细胞抗原表位多肽,分别来自于13个结核抗原:Rv3793、Rv05 85c、Rv1490、Rv0446c、Rv 1547、Rv2201、Rv3573、Rv0197、Rv0674、Rv1566c、Rv1798、Rv2318和Rv2941。这些多肽的反应灵敏度在1.9%～30%之间,特异性在96.81%～100%之间。位于同一个抗原的多肽联合诊断后,单个抗原的反应灵敏度可达到1.9%～50%。Rv2351c蛋白的灵敏度为61.7%,特异度为91.4%。在动物实验中,11条多肽和Rv2351c蛋白均能诱导产生不同程度的细胞免疫应答。其中 P1(Rv3793)、P24(Rv0585c)、P26(Rv0585c)、P55(Rv1490)、P120(Rv0446c)、P121(Rv0446c)和 Rv2351c 主要诱导产生 Th1 和 Th2 混合型细胞免疫应答,P123(Rv0446c)、P136(Rv2201)、P166(Rv0197)、P309(Rv1798)和P318(Rv2318)多肽主要产生Th1型细胞免疫应答。与对照组相比,多肽P1(Rv3793)、P26(Rv0585c)、P120(Rv0446c)和 P121(Rv0446c)能引起小鼠体内 CD3+CD4+T 细胞的比例升高,多肽有 P123(Rv0446c)、P166(Rv0197)、P309(Rv1798)、P318(Rv2318)和 Rv2351c 蛋白均能引起小鼠体内 CD3+CD8+T细胞的比例显著升高,P24(Rv0585c)、P55(Rv1490)和 P136(Rv2201)能够同时引起CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的比例同时升高。这11条多肽诱导产生的IgG抗体的滴度从1:44～1:5079不等,其中P121(Rv0446c)和P166(Rv0197)能够引起1:1000以上的IgG抗体滴度。Rv2351c引起IgG的抗体滴度达到1:2.2×106。Rv0674的9条B细胞表位多肽的反应灵敏度在54.55%～79.55%,特异度在71.25%～95%,除P203、P204以外,其他多肽的ROC曲线下面积均大于0.8。Rv1411c的7条多肽的反应灵敏度在46.5%～88.6%,特异度在75%～92.5%。Rv1477的6条多肽反应灵敏度为60.23%～76.14%,特异度在86.25%～95%。除了 P220之外,且ROC曲线下面积均在0.8以上。本研究成功鉴定的来自14个新结核抗原30个人T细胞表位和Rv2351c蛋白具有一定的抗原性,动物实验结果证实其中11条T细胞表位多肽和Rv2351c蛋白在小鼠体内能引起细胞免疫应答和体液免疫应答,具有一定的免疫原性。本研究对3个新抗原的22条人B细胞表位进行了血清学评价,结果证实这22条B细胞表位具有一定的血清学诊断价值。综上所述,本研究鉴定出来16个结核分枝杆菌新抗原,为结核病的诊断和疫苗的研究提供了一定的基础。