论文部分内容阅读
目的观察古方一贯煎（yiguanjian decoction,YGJ）对川楝素诱导的肝细胞损伤的影响,并探讨其保护肝细胞的作用机制。方法1、体内实验:川楝素（Toosendanin,TSN）建立急性小鼠肝损伤模型,同时设置一贯煎（YGJ）干预组。（1）生化方法检测小鼠血清ALT、AST活性观察小鼠肝功能改变。（2）H＆E染色观察小鼠肝组织病理变化。（3）Western-blot方法检测Parp-1蛋白质、Sirt-1蛋白质含量以及Parp-1蛋白质活性即蛋白质多聚核糖化（poly ADP–ribose,Par）。2、体外实验:小鼠胚胎肝细胞系（BNL CL.2）,建立TSN和过氧化氢（H2O2）两种细胞损伤模型并用YGJ干预。（1）CCK8比色法检测肝细胞活力。（2）比色法检测肝细胞8-Ohd G含量结合激光共聚焦法观察γ-H2AX（磷酸化组蛋白H2A变异体）分析细胞DNA损伤。（3）Annexin V/PI双染色流式细胞术检测肝细胞凋亡。（4）荧光探针DCFH-DA检测肝细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量。（5）5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU）掺入实验结合激光共聚焦法检测细胞增殖。（6）免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）检测Parp-1蛋白乙酰化。结果体内实验:（1）C57BL小鼠体重、肝重结果:与对照组（Control）相比,模型组TSN及一贯煎干预组（TSN/YGJ）小鼠体重、肝重明显下降（p＜0.0001）,而TSN/YGJ组与TSN组无明显差异（p＞0.05）。（2）血清ALT、AST结果:与Control组相比,TSN组小鼠血清ALT、AST显著升高（p＜0.001）;与TSN组相比,TSN/YGJ组血清ALT、AST显著下降（p＜0.05）。（3）H＆E染色结果:Control组肝细胞排列整齐,未见脂质空泡形成,中央静脉区未见肝细胞坏死及炎症细胞浸润;TSN组可见中央静脉区肝细胞坏死及炎症细胞浸润;TSN/YGJ组中央静脉区少量炎症细胞浸润,显示炎症有所改善。（4）Western-blot结果:与Control组相比,TSN组小鼠Parp-1、Sirt-1蛋白表达量显著增加（p＜0.01）,TSN组Parp-1蛋白Par化有所下降,但无统计学差异（p＞0.05）;与TSN组相比,TSN/YGJ组Parp-1蛋白表达量明显下降（p＜0.05）、Sirt-1蛋白表达量显著下降（p＜0.01）,Parp-1蛋白Par化明显升高（p＜0.05）。体外实验:（1）CCK8细胞活力结果:0.1μM、1μM、10μM、100μM的TSN均能降低细胞活力（p＜0.01、p＜0.001、p＜0.0001、p＜0.0001）,且10μM的TSN作用24小时后,对细胞活力的抑制率接近20%;50μg/ml的YGJ作用24小时无明显肝细胞毒性,可明显明显促进肝细胞活力（p＜0.0001）。10μMTSN可明显降低肝细胞活力,50μg/ml的YGJ可拮抗TSN诱导的肝细胞损伤（p＜0.01）。（2）Annexin V/PI流式结果:与Control组相比,TSN组肝细胞随TSN作用时间增加早期凋亡和晚期凋亡细胞显著增加,与TSN组相比,TSN/YGJ组于TSN作用12小时和24小时可显著减少晚期凋亡肝细胞。（3）EDU掺入实验结果（绿色荧光阳性细胞率）:与Control组相比,TSN组随作用时间增加,EDU绿色荧光阳性细胞率逐渐降低,TSN作用24小时最低（p＜0.0001）;与TSN组相比,TSN/YGJ组EDU阳性细胞率显著增加（p＜0.05）,表明YGJ可明显增加肝细胞增殖。（4）ROS检测结果:与Control组相比,1μMTSN即可升高肝细胞内ROS含量（p＞0.05）,10μM-100μMTSN可明显升高肝细胞内ROS含量（p＜0.01）;10μMTSN作用1-24小时,肝细胞内ROS含量随作用时间延长而逐渐升高,24小时达最高值（p＜0.001）。（5）8-Ohd G含量检测结果:与Control组相比,10μM浓度TSN作用24小时后8-Ohd G上升显著（p＜0.0001）;与TSN组相比,25μg/ml、50μg/ml浓度YGJ干预可显著降低肝细胞内8-Ohd G含量（p＜0.05、p＜0.0001）。（6）γ-H2AX荧光染色结果（红色荧光强度）:与Control组相比,自10μM浓度TSN作用6小时起红色荧光逐渐增强（p＜0.05）,洛铂对照组（LBP）随作用时间的延长红色荧光逐渐增强并持续至24小时（p＜0.05）;与TSN组相比,TSN/YGJ组红色荧光显著减弱（p＜0.05）;与LBP组相比,LBP/YGJ组红色荧光显著减弱（p＜0.05）;表明YGJ干预可明显减少TSN或LBP诱导的细胞DNA损伤。（7）Westernblot结果:与Control组相比,TSN组Parp-1蛋白表达呈时间依赖性增加（p＜0.05）,12小时达峰值（p＜0.0001）,至24小时有所下降（p＜0.0001）;与TSN组相比,TSN/YGJ组肝细胞Parp-1含量明显减少（p＜0.01）,且具有YGJ浓度依赖性（p＜0.01）;（8）Parp-1蛋白Par化检测结果:与Control组相比,TSN组Parp-1蛋白Par化呈时间依赖性减少（p＜0.05）,1小时为峰值（p＜0.05）,至24小时达谷底（p＜0.05）;与TSN组相比,TSN/YGJ组Parp-1蛋白Par化显著增加（p＜0.0001）,且与YGJ作用浓度呈依赖性（p＜0.001）;（9）Parp-1蛋白乙酰化检测结果:TSN作用6小时,Parp-1乙酰化明显增加,加入YGJ干预后,Parp-1蛋白乙酰化明显下降。（10）Sirt-1蛋白表达检测:与Control组相比,TSN组Sirt-1蛋白表达于TSN作用6、12小时增加最明显（p＜0.05）,至24小时有所减少(（p＜0.05）;与TSN组相比,TSN/YGJ组肝细胞Sirt-1表达有所减少（p＞0.05）,且YGJ作用浓度越高,Sirt-1表达下降越明显（p＜0.0001）。（11）Sirt-1抑制剂实验结果:1μM浓度的EX527（Sirt-1抑制剂）预处理肝细胞后,与TSN组相比,TSN/EX527组Parp-1表达和Parp-1蛋白Par化均显著增加（p＜0.0001,p＜0.001）;与TSN/YGJ组相比,TSN/YGJ/EX527组Parp-1表达无明显变化,Parp-1蛋白Par化显著增加（p＜0.0001）。（12）EDU检测结果（绿色荧光阳性细胞率）:与Control组相比,随着H2O2作用时间延长,绿色荧光阳性细胞逐渐减少,H2O2作用6小时,阳性细胞率最低（p＜0.0001）;与H2O2组相比,H2O2/YGJ组绿色荧光阳性细胞明显增加（p＜0.05）,表明H2O2诱导肝细胞损伤中,YGJ可促进肝细胞增殖。（13）8-Ohd G含量检测结果:与Control组相比,500μM浓度H2O2作用3小时,肝细胞内8-Ohd G含量显著上升（p＜0.0001）;与H2O2组相比,H2O2/YGJ组肝细胞内8-Ohd G含量显著下降（p＜0.05）。（14）γ-H2AX荧光染色结果（红色荧光强度）:与Control组相比,随着H2O2作用时间的延长自6小时起红色荧光增强,24小时减弱（p＜0.05）;与H2O2组相比,H2O2/YGJ组红色荧光显著减弱（p＜0.05）,表明YGJ可显著降低H2O2诱导的肝细胞DNA损伤。（15）Parp-1蛋白表达检测结果:与Control组相比,H2O2组Parp-1蛋白表达随H2O2作用时间延长自6小时起显著增加（p＜0.01）;与H2O2组相比,H2O2/YGJ组肝细胞Parp-1表达显著减少（p＜0.01或p＜0.05）;（16）Parp-1蛋白Par化检测结果:与Control组相比,随H2O2作用时间延长,肝细胞Parp-1蛋白Par化逐渐增加（p＜0.01）,6小时达峰值（p＜0.0001）,与H2O2组相比,H2O2/YGJ组肝细胞Parp-1蛋白Par化显著增加（p＜0.0001）。（17）Sirt-1蛋白表达检测结果:与Control组相比,6小时H2O2组Sirt-1蛋白表达显著下降（p＜0.0001）,与H2O2组相比,H2O2/YGJ组肝细胞Sirt-1表达明显增加（p＜0.05）。结论（1）TSN可通过损伤肝细胞导致肝细胞坏死,引起小鼠急性肝损伤,而YGJ改善TSN诱导的小鼠急性肝损伤。这种作用可能与DNA损伤及修复作用有关。（2）TSN在肝细胞中代谢产生ROS并引发DNA损伤是其致肝细胞损伤/死亡的主要机制之一,YGJ可通过调控参与DNA损伤修复的关键蛋白酶PARP-1的活性修复TSN诱导的DNA损伤。（3）H2O2是最强烈的ROS诱导剂之一,可诱导DNA损伤并继发肝细胞损伤/凋亡,YGJ可通过降低肝细胞中ROS含量、减少DNA损伤、保护肝细胞。