杭锦旗小花棘豆内生真菌与苦马豆素关系的研究

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小花棘豆广泛分布于内蒙古的草原区和荒漠区,许多植株含生物碱苦马豆素,苦马豆素可抑制细胞内的甘露糖苷酶,牲畜采食一定量小花棘豆会中毒,引起疯草病,毒草蔓延时造成草原畜牧业的重大损失。对苦马豆素毒性机制的研究具有重要的理论意义和应用价值。另外,小花棘豆有重要药用价值和生态价值,脱去苦马豆素的小花棘豆是优良牧草,苦马豆素还是极具潜力的抗肿瘤药物。本研究用小花棘豆单株植物茎切段做外植体,体外分离培养内生真菌,研究内生真菌菌落形态特征,扩增真菌5.8SrDNA/ITS区并进行序列测定,所得序列用DNASTAR软件包中的MegAlign软件与已发表的小花棘豆和其他疯草内生真菌序列进行同源比对,根据分子生物学及微生物学研究的结果推测内生真菌类群;从未培养出内生真菌的小花棘豆单株植物中扩增真菌5.8SrDNA/ITS区进行序列测定,提取小花棘豆单株植物及其内生真菌中的苦马豆素,用气相色谱法测定其苦马豆素含量,分析研究小花棘豆苦马豆素与内生真菌之间的关系;利用T载体克隆来分析总DNA中含有两条真菌条带的样品。得到以下研究结果:1.体外分离培养出7株小花棘豆内生真菌,其中6株小花棘豆内生真菌的菌落微生物形态特征与已发表的10株小花棘豆内生真菌和埃里砖格孢属真菌Embellisia sp.L12一致;其5.8SrDNA/ITS序列与10株小花棘豆内生真菌序列相同,与Embellisia sp.L12相比在5.8SrDNA区有一个变异位点,认为小花棘豆内生真菌应属于埃里砖格孢属真菌;另一株内生真菌HJ1.9虽菌落形态稍有差别,但其5.8SrDNA/ITS序列与10株小花内生真菌及本研究的6株内生真菌序列一致度达98.5%;与Embellisia sp.L12菌株的序列一致度是98.3%,认为内生真菌HJ1.9也属于埃里砖格孢属真菌。2.45株小花棘豆单株植物都扩增出真菌条带,并都被测出含有苦马豆素,分离和检测到苦马豆素的单株植物里都检测到有内生真菌,分离的内生真菌中苦马豆素含量高于其宿主植物中苦马豆素的含量。不同种群、不同植株苦马豆素含量有差异。HJ1种群15株植物的苦马豆素平均含量为19.84ug/g,含量范围是0.28ug/g-172.70ug/g;HJ2种群15株植物的苦马豆素平均含量为102.19ug/g,含量范围是1.50ug/g-305.30ug/g;HJ3种群12株植物的苦马豆素平均含量为73.32ug/g,含量范围是0.25ug/g-222.20ug/g。3. T-A克隆结果显示:3株克隆出一条序列的经鉴定属于Embellisia;10株克隆出两条序列的经鉴定一条属于Embellisia;另一条2株属于Erysiphe、5株属于Alternaria,另外3株目前无法鉴定。
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