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沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌,在全世界范围内普遍存在,易感染各种家畜家禽,对养殖业的生产和人类的食品卫生安全造成威胁。现代规模化家禽养殖业中,沙门菌的感染主要以O:9血清型的鸡白痢沙门菌和肠炎沙门菌为主。这些沙门菌能引起雏鸡极高的发病率和死亡率,被感染的成年鸡表现为无症状带菌,通过垂直传播感染鸡蛋,从而降低下一代雏鸡的成活率,且成年鸡的产蛋能力也会因感染显著下降。这些都对养禽业造成巨大的经济损失。感染沙门菌的家禽作为主要传染源之一,是沙门菌防控与净化的关键控制点。因此,快速、精确、有效的沙门菌检测方法,有利于尽早发现家禽沙门菌的感染,从而切断传染源,保证食品的卫生安全和人类的健康。沙门菌血清型划分的主要依据是其细菌表面O-抗原的差异。O-抗原作为革兰阴性菌表面的O-特异侧链,由不同的重复寡糖单元构成,位于细胞壁结构中的脂多糖(LPS)上,能够诱导动物机体产生特异性的抗体,可作为沙门菌感染的诊断靶标。目前,被广泛使用的禽沙门菌抗体诊断方法以基于O-抗原与抗体结合的玻板凝集试验(PAT)为主。但在临床应用中,PAT检测依靠肉眼观察,所用的染色抗原存在批次差异,导致PAT的检测结果不够稳定。酶联免疫吸附实验(ELISA)相较PAT,具有更好的敏感性和特异性,且检测结果可数字化,结果更加清晰。因此,本研究成功制备了抗沙门菌0:9抗原的单克隆抗体,并初步建立了检测0:9血清型沙门菌的夹心ELISA方法。1.抗沙门菌O:9抗原的单克隆抗体制备通过热酚水法提取肠炎沙门菌C50041的LPS,经蒽酮比色定糖法测定,浓度为3.641 mg/mL。将LPS上的脂质A与核心多糖通过乙酸水解后获得O-特异侧链,并与KLH蛋白载体进行偶联。将灭活的沙门菌、沙门菌LPS和O-抗原-KLH作为免疫原,组合设计5组不同的免疫程序,对6周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫。将分泌抗0:9抗原抗体的小鼠脾脏B细胞与SP2/0细胞进行融合后,经间接ELISA和PAT联合筛选,获得7株能够稳定分泌抗沙门菌0:9抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D3、1H3、2A4、5C11、5E1、5F11、5F12。抗体亚型鉴定结果显示,仅5F11为IgG3型,其余均为IgM型。7株单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清的抗体效价最高在2.0×105以上,小鼠腹水的抗体效价最高可达3.0×106以上。通过PAT、间接ELISA、Western blotting的实验分析后,7株单克隆抗体均能特异性地与0:9抗原反应,且无交叉反应,特异性良好。2.抗沙门菌O:9抗原单克隆抗体夹心ELISA检测方法的初步建立制备抗沙门菌O:9抗原的单克隆抗体后,初步建立用于检测O:9血清型沙门菌的夹心ELISA方法。选取特异性最高的5F11作为夹心ELISA方法中的检测抗体,经HRP标记后,抗体效价在51,200以上。在建立夹心ELISA方法中,利用夹心ELISA筛选出抗原捕获能力最强的单克隆抗体1D3作为捕获抗体,通过方阵实验确定捕获抗体的最佳包被浓度为320 ng/mL,检测抗体的最佳工作浓度为320ng/rmL,样品最短预增菌时间为24 h,样品最佳预处理条件为沸水浴10 min,细菌最低检出浓度为1.0×106 CFU/孔。细菌模拟样品经建立的夹心ELISA方法检测,能够特异性地检测出含O:9抗原的沙门菌,且其它细菌均呈阴性结果,无交叉反应,特异性良好。该方法也能够从人工感染鸡白痢沙门菌的鸡粪便中检测出相应的沙门菌。夹心ELISA方法只需将样品进行预增菌即可进行检测,省去传统平板划线分离细菌的过程,检测速度得到较大的提升。