近年来研究发现磷酸化蛋白质在生物矿化过程中起着重要的作用,而卵黄高磷蛋白(PV)是目前自然界中磷酸化程度最高的蛋白质之一,已有部分研究证明了卵黄高磷蛋白具有矿化调节作用,但关于它调控矿化的活性位点及具体机制还不明确。本课题以卵黄高磷蛋白调控骨矿化的功能为核心,构建了不同的体外矿化模型,发现了卵黄高磷蛋白体外促进矿化的现象并探讨了其调控矿化的机制。首先构建静电纺丝胶原蛋白膜仿生溶液矿化体系,并研究卵黄高磷蛋白在此体系中的作用及调控机制;其次采用MC3T3-E1成骨细胞模型研究卵黄高磷蛋白磷酸化程度对成骨细胞矿化功能的影响及其机制;最后构建RAW264.7破骨细胞模型,研究卵黄高磷蛋白对破骨细胞活性和功能的影响。综合三种不同的矿化体系研究卵黄高磷蛋白的矿化功能,对其矿化机制的阐释及应用做相应的理论支撑。建立了基于十倍模拟体液和电纺胶原纤维膜的体外矿化模型。探讨了各种矿化条件对羟基磷灰石成核和生长的影响。优化了矿化方式,矿化液的量,矿化液pH值,矿化过程和矿化时间等。扫描电镜结果显示,在动态矿化模式下,于pH5.7的十倍模拟体液下矿化3小时,纳米纤维膜表面能产生结晶均匀和晶形良好的无机矿物层,该矿物质经FTIR和XRD鉴定为羟基磷灰石,该晶体在电纺胶原纤维膜表面和内部均有分布。探讨了PV和牛血清蛋白(BSA)作为非胶原蛋白质(NCPs)对电纺胶原纤维膜矿化体系的调控作用。通过SEM观察PV,BSA调控下纺丝界面上矿物的形貌,形成部位,跟踪矿化物相变及晶体形成的时间。采用EDS、XRD、XPS等分析矿化物的化学组成、晶体结构,阐明PV,BSA在纺丝界面上调控磷酸钙矿物形成的效果和机制。该体系被证明是促进骨样磷酸钙涂层形成的快速有效的方法,即通过引入PV和BSA构建了一个良好有序的仿生矿化矿化体系:矿化过程中10×SBF中PV或BSA的存在均显著促进了电纺胶原纤维矿化体系中DCPD向HA转化,且PV比BSA更加快速地促进了矿化物相变过程。PV结合或吸附在矿物上,通过静电相互作用提高微观环境下Ca2+的浓度,从而促进矿化,HPLC跟踪不同时间溶液中PV含量,结果表明在矿化物相变后期,PV复溶至矿化溶液中。探索了不同磷酸化程度的PV对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响以及可能的作用机制。首先制备了不同脱磷酸化程度的卵黄高磷蛋白,其脱磷率分别22.67%、45.86%、59.24%、75.13%。然后分别通过CCK-8法和碱性磷酸酶测定法分析磷酸化程度对MC3T3-E1细胞的增殖和分化的影响;使用茜素红染色表征PV磷酸化程度对成骨细胞矿化的影响;通过RT-PCR分析MC3T3-E1细胞系中BMP-2,RANKL和OPG mRNA的表达。结果表明卵黄高磷蛋白的磷酸化是促进MC3T3-E1细胞增殖、分化、矿化的关键因素。即高磷酸化程度的PV(脱磷酸化度<45%)组的增殖活力,ALP活性、矿化节点数、BMP-2 mRNA、OPG/RANKL mRNA的比值较对照组均有显著性增加(P<0.05),且呈磷酸化程度依赖性,100μg/mL PV处理组的效果最好,而最大脱磷率的PV组,效果等于或明显低于对照组。研究了不同浓度PV(0、50、100、200和500μg/mL)对RAW264.7细胞增殖、周期、凋亡的影响,发现低浓度PV对RAW264.7细胞有促进增殖和抑制其凋亡的作用,100μg/mL PV时效果最好。CCK-8法表征增殖活力,发现100μg/mL PV浓度时增殖活力高出对照组64%-76%。通过分析PV作用24h、48h后对细胞周期的影响发现,不同浓度的PV均对细胞增殖均有促进作用,与对照组相比低浓度PV(50、100、200μg/mL)处理细胞后S期细胞百分数、增殖指数PI增加值更多。凋亡结果表明,50、100、200μg/mL PV组凋亡率都显著低于空白对照组,500μg/mL时凋亡率高于空白组。另外,TRAP染色细胞分化形态学及TRAP活性方面,不同浓度的PV均可显著减少破骨细胞数量,及降低TRAP活性(P<0.05),且呈浓度依赖性,200μg/mL为最佳抑制浓度。总之,PV并非通过抑制RAW264.7细胞生长而是显著地降低TRAP的活性,进而抑制RAW264.7细胞分化成为破骨细胞。