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目的:
头颈部癌主要包括口腔和咽喉部的肿瘤，其恶性程度和好发性占据世界第六，是上消化道系统较常见和易复发的恶性肿瘤，其鳞状细胞癌是最为常见的病理类型。头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC）是一种表型具高度侵袭性的实体瘤，临床表现较差，主要表现为肿瘤易复发，局部及远处淋巴结转移等。目前，最为常见的临床治疗方法为手术治疗、放射治疗和化学药物治疗，尽管在过去的几十年中，治疗手段的提升的同时也提高了患者的治愈率和预后生存期，但是结果依然很不理想。因此，依然要去寻找更为有效的治疗方法。
最近几年，肿瘤免疫治疗获得了广泛性关注，其目的是为了激活免疫系统达到抑制肿瘤生长从而清除肿瘤的目的。其中，嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T）治疗是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法。CAR-T在治疗血液肿瘤方面做出了突出贡献，对于实体肿瘤而言，目前的CAR-T仍然还面临许多困难，这主要是由于实体瘤的肿瘤组织结构特性，特异性抗原的缺失和较强的免疫抑制肿瘤微环境所导致。比如不能够有效地浸润到肿瘤组织内部，CAR-T细胞存活时间过短等等。近年来已经尝试了许多策略来克服这些障碍，比如用敲除P D-1（程序性死亡受体1）表达或分泌细胞因子/趋化因子的方法来武装CAR-T细胞；将CAR-T细胞与其他治疗方法联用。因此，通过优化CAR载体设计，发现有效的靶标来开发更有能力更安全的免疫治疗方法是很有必要的。
MUC1（mucins）属于粘蛋白家族，是一种Ⅰ型跨膜蛋白，正常情况下常在多种上皮细胞类型上表达，但当正常细胞向肿瘤的转化过程中，MUC1常过度表达，可达正常时的表达量的百倍以上，极性分布丧失，整个细胞表面均可表达，组织结构也相应改变，这可能是糖基化不全的结果。MUC1粘蛋白在维持体内平衡和促进细胞存活方面起着重要作用。已有研究表明MUC1在HNSCC细胞和正常口腔黏膜上皮细胞膜表面的表达有差异，说明MUC1可以作为HNSCC的一个有效检测和治疗标记点。
IL22（Interleukin-22，白细胞介素22）是属于IL10（Interleukin-10，白细胞介素10）家族的细胞因子，并表达在Th17（T helper cell17，辅助性T细胞17）的细胞子集上。IL22主要是由CD4T细胞产生，NK（Natural killer cell，自然杀伤细胞）细胞也可以产生少量的IL22。另外，IL22具有促进抗微生肽的形成，抵抗细菌或病毒感染，促进角质形成细胞的生成等作用，参与人体多种炎性疾病或免疫性疾病的免疫病理和防护过程。多项研究表明，IL22在大多数急性炎性疾病中具有抗炎症、诱导抗氧化活性、促进再生的重要作用。然而，有研究报道IL22可能在某些病理生理条件下发挥病理作用，如慢性炎症。已经有报道指出，外源性添加人源IL22重组蛋白可增加炎性肿瘤微环境中肿瘤表面MUC1的表达。因此，将此结果延伸至我们的研究中，以期增强抗原表达提高CAR-T的靶向杀伤功能。
目前，靶向MUC1的CAR-T治疗已经在非小细胞肺癌和乳腺癌上有所研究，但是关于头颈鳞癌的CAR-T治疗的报道还很少。因此，在本研究中，将MUC1作为治疗靶点，验证了IL22细胞因子可以诱导头颈鳞癌细胞系中MUC1抗原的上调，接着又利用分子克隆技术分别构建了以4-1BB为共刺激区域的二代CAR结构和可以分泌IL22细胞因子的四代CAR结构，通过慢病毒转染CD3+T细胞构建CAR-T细胞，并且分别在体外细胞系和体内动物模型验证两种不同CAR-T细胞的杀伤功能。经过该课题的研究，期望可以为头颈鳞癌患者提供更为有效的实验室基础研究和治疗选择。
第一部分 IL22促进MUC1在头颈部鳞癌患者中的表达及分析
方法:
1）数据库统计分析MUC1在头颈鳞癌和相邻无瘤组织中的表达差异。
2）免疫组化实验检测MUC1在头颈鳞癌临床样本和相邻无瘤组织中的表达。
3）流式细胞技术检测MUC1在口腔黏膜上皮细胞和多种头颈鳞癌细胞系中的表达。
4）流式细胞技术检测加入IL22重组蛋白对头颈鳞癌细胞系中MUC1表达的影响。
结果:
1）MUC1mRNA在头颈鳞癌组织的表达高于相邻无瘤组织，P＜0.05。
2）头颈鳞癌组织中的MUC1蛋白表达高于相邻无瘤组织，P＜0.05。
3）所应用细胞系中均能检测到MUC1的表达，口腔黏膜上皮中MUC1表达量最低，鳞癌细胞系中表达较高。
4）加入IL22重组蛋白72h后，口腔黏膜上皮细胞OME和头颈鳞癌细胞系Cal27无明显变化，其余细胞系中MUC1的表达均有提高。
小结:
1）头颈鳞癌组织中MUC1的表达高于相邻无瘤组织，MUC1可能是头颈鳞癌患者的一个潜在靶点；
2）MUC1在头颈鳞癌多个细胞系中均有表达且IL22重组蛋白的加入可以诱导MUC1表达的提高。
第二部分 IL22分泌型CAR-T细胞对MUC1阳性头颈鳞癌细胞有更好的杀伤功能
方法:
1）构建两种CAR结构并通过慢病毒包装转染至激活的CD3+T细胞中，检测转染效率。
2）流式细胞术检测IL22细胞因子对T细胞分化功能的影响；
3）流式细胞技术检测两种CAR-T细胞在体外对MUC1阳性的头颈鳞癌细胞的杀伤功能，ELISA实验检测功能性细胞因子的释放水平；
4）构建头颈鳞癌异种移植小鼠模型，通过尾静脉回输CAR-T细胞，检测治疗效果。
结果:
1）构建成功pCDH-MUC1-CAR及pCDH-MUC1-IL22-CAR质粒，转染效率均大于50%，T细胞状态良好；
2）IL22细胞因子的加入有利于T细胞向记忆型分化，并提高二代CAR-T细胞对MUC1阳性的头颈鳞癌细胞的靶向杀伤功能；
3）与二代CAR-T细胞相比，可分泌IL22细胞因子的四代CAR-T细胞对MUC1阳性头颈鳞癌的杀伤作用更强，P＜0.05；
4）动物实验结果显示，CAR-T细胞对肿瘤的生长有抑制作用，且可分泌IL22细胞因子的CAR-T细胞具有更强的抑制肿瘤生长和浸润能力，P＜0.05。
小结:
1）经过anti-MUC1嵌合抗原受体修饰的T细胞能够识别并杀伤MUC1表达阳性的头颈鳞癌细胞系；
2）IL22细胞因子的加入可促进T细胞分化，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能；
3）体内和体外实验表明可分泌IL22细胞因子的四代CAR-T细胞较二代CAR-T细胞对MUC1阳性的肿瘤细胞具有更精确的靶向杀伤功能和肿瘤浸润能力。
结论:
1）MUC1在头颈鳞癌中高表达，且IL22可提高头颈鳞癌细胞中MUC1的表达；
2）可分泌IL22细胞因子的CAR-T细胞与二代CAR-T细胞相比，能更加精准的靶向肿瘤细胞，具有更强的肿瘤抑制能力以及动物体内模型治疗效果。
头颈部癌主要包括口腔和咽喉部的肿瘤，其恶性程度和好发性占据世界第六，是上消化道系统较常见和易复发的恶性肿瘤，其鳞状细胞癌是最为常见的病理类型。头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC）是一种表型具高度侵袭性的实体瘤，临床表现较差，主要表现为肿瘤易复发，局部及远处淋巴结转移等。目前，最为常见的临床治疗方法为手术治疗、放射治疗和化学药物治疗，尽管在过去的几十年中，治疗手段的提升的同时也提高了患者的治愈率和预后生存期，但是结果依然很不理想。因此，依然要去寻找更为有效的治疗方法。
最近几年，肿瘤免疫治疗获得了广泛性关注，其目的是为了激活免疫系统达到抑制肿瘤生长从而清除肿瘤的目的。其中，嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell，CAR-T）治疗是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法。CAR-T在治疗血液肿瘤方面做出了突出贡献，对于实体肿瘤而言，目前的CAR-T仍然还面临许多困难，这主要是由于实体瘤的肿瘤组织结构特性，特异性抗原的缺失和较强的免疫抑制肿瘤微环境所导致。比如不能够有效地浸润到肿瘤组织内部，CAR-T细胞存活时间过短等等。近年来已经尝试了许多策略来克服这些障碍，比如用敲除P D-1（程序性死亡受体1）表达或分泌细胞因子/趋化因子的方法来武装CAR-T细胞；将CAR-T细胞与其他治疗方法联用。因此，通过优化CAR载体设计，发现有效的靶标来开发更有能力更安全的免疫治疗方法是很有必要的。
MUC1（mucins）属于粘蛋白家族，是一种Ⅰ型跨膜蛋白，正常情况下常在多种上皮细胞类型上表达，但当正常细胞向肿瘤的转化过程中，MUC1常过度表达，可达正常时的表达量的百倍以上，极性分布丧失，整个细胞表面均可表达，组织结构也相应改变，这可能是糖基化不全的结果。MUC1粘蛋白在维持体内平衡和促进细胞存活方面起着重要作用。已有研究表明MUC1在HNSCC细胞和正常口腔黏膜上皮细胞膜表面的表达有差异，说明MUC1可以作为HNSCC的一个有效检测和治疗标记点。
IL22（Interleukin-22，白细胞介素22）是属于IL10（Interleukin-10，白细胞介素10）家族的细胞因子，并表达在Th17（T helper cell17，辅助性T细胞17）的细胞子集上。IL22主要是由CD4T细胞产生，NK（Natural killer cell，自然杀伤细胞）细胞也可以产生少量的IL22。另外，IL22具有促进抗微生肽的形成，抵抗细菌或病毒感染，促进角质形成细胞的生成等作用，参与人体多种炎性疾病或免疫性疾病的免疫病理和防护过程。多项研究表明，IL22在大多数急性炎性疾病中具有抗炎症、诱导抗氧化活性、促进再生的重要作用。然而，有研究报道IL22可能在某些病理生理条件下发挥病理作用，如慢性炎症。已经有报道指出，外源性添加人源IL22重组蛋白可增加炎性肿瘤微环境中肿瘤表面MUC1的表达。因此，将此结果延伸至我们的研究中，以期增强抗原表达提高CAR-T的靶向杀伤功能。
目前，靶向MUC1的CAR-T治疗已经在非小细胞肺癌和乳腺癌上有所研究，但是关于头颈鳞癌的CAR-T治疗的报道还很少。因此，在本研究中，将MUC1作为治疗靶点，验证了IL22细胞因子可以诱导头颈鳞癌细胞系中MUC1抗原的上调，接着又利用分子克隆技术分别构建了以4-1BB为共刺激区域的二代CAR结构和可以分泌IL22细胞因子的四代CAR结构，通过慢病毒转染CD3+T细胞构建CAR-T细胞，并且分别在体外细胞系和体内动物模型验证两种不同CAR-T细胞的杀伤功能。经过该课题的研究，期望可以为头颈鳞癌患者提供更为有效的实验室基础研究和治疗选择。
第一部分 IL22促进MUC1在头颈部鳞癌患者中的表达及分析
方法:
1）数据库统计分析MUC1在头颈鳞癌和相邻无瘤组织中的表达差异。
2）免疫组化实验检测MUC1在头颈鳞癌临床样本和相邻无瘤组织中的表达。
3）流式细胞技术检测MUC1在口腔黏膜上皮细胞和多种头颈鳞癌细胞系中的表达。
4）流式细胞技术检测加入IL22重组蛋白对头颈鳞癌细胞系中MUC1表达的影响。
结果:
1）MUC1mRNA在头颈鳞癌组织的表达高于相邻无瘤组织，P＜0.05。
2）头颈鳞癌组织中的MUC1蛋白表达高于相邻无瘤组织，P＜0.05。
3）所应用细胞系中均能检测到MUC1的表达，口腔黏膜上皮中MUC1表达量最低，鳞癌细胞系中表达较高。
4）加入IL22重组蛋白72h后，口腔黏膜上皮细胞OME和头颈鳞癌细胞系Cal27无明显变化，其余细胞系中MUC1的表达均有提高。
小结:
1）头颈鳞癌组织中MUC1的表达高于相邻无瘤组织，MUC1可能是头颈鳞癌患者的一个潜在靶点；
2）MUC1在头颈鳞癌多个细胞系中均有表达且IL22重组蛋白的加入可以诱导MUC1表达的提高。
第二部分 IL22分泌型CAR-T细胞对MUC1阳性头颈鳞癌细胞有更好的杀伤功能
方法:
1）构建两种CAR结构并通过慢病毒包装转染至激活的CD3+T细胞中，检测转染效率。
2）流式细胞术检测IL22细胞因子对T细胞分化功能的影响；
3）流式细胞技术检测两种CAR-T细胞在体外对MUC1阳性的头颈鳞癌细胞的杀伤功能，ELISA实验检测功能性细胞因子的释放水平；
4）构建头颈鳞癌异种移植小鼠模型，通过尾静脉回输CAR-T细胞，检测治疗效果。
结果:
1）构建成功pCDH-MUC1-CAR及pCDH-MUC1-IL22-CAR质粒，转染效率均大于50%，T细胞状态良好；
2）IL22细胞因子的加入有利于T细胞向记忆型分化，并提高二代CAR-T细胞对MUC1阳性的头颈鳞癌细胞的靶向杀伤功能；
3）与二代CAR-T细胞相比，可分泌IL22细胞因子的四代CAR-T细胞对MUC1阳性头颈鳞癌的杀伤作用更强，P＜0.05；
4）动物实验结果显示，CAR-T细胞对肿瘤的生长有抑制作用，且可分泌IL22细胞因子的CAR-T细胞具有更强的抑制肿瘤生长和浸润能力，P＜0.05。
小结:
1）经过anti-MUC1嵌合抗原受体修饰的T细胞能够识别并杀伤MUC1表达阳性的头颈鳞癌细胞系；
2）IL22细胞因子的加入可促进T细胞分化，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能；
3）体内和体外实验表明可分泌IL22细胞因子的四代CAR-T细胞较二代CAR-T细胞对MUC1阳性的肿瘤细胞具有更精确的靶向杀伤功能和肿瘤浸润能力。
结论:
1）MUC1在头颈鳞癌中高表达，且IL22可提高头颈鳞癌细胞中MUC1的表达；
2）可分泌IL22细胞因子的CAR-T细胞与二代CAR-T细胞相比，能更加精准的靶向肿瘤细胞，具有更强的肿瘤抑制能力以及动物体内模型治疗效果。