“胚胎植入是播种生命之苗，肿瘤浸润转移则是扣击死亡之门”[1]。但是，这两个截然不同的生理过程，却在细胞增殖分化、免疫逃逸和侵袭信号转导等诸多方面有着惊人的相似之处。胚胎的成功植入需要胚胎绒毛外滋养细胞(extrayillous trophoblast，EVTs)发挥类似肿瘤浸润转移的特性，即识别、黏附并降解细胞外基质，侵入血管内皮，从而使母体血管重建，开启胎盘的血液供应。EVT侵袭与肿瘤浸润转移的根本不同是前者受到严格的时空调控，表现为“有控性侵袭”，后者则表现为“无控性侵袭”[2]。EVT侵袭异常，可引起一系列的妊娠相关疾病：过度侵入可致绒毛膜癌，侵入过浅与自然流产、胎儿宫内发育迟缓、先兆子痫等疾病的发生相关。然而，迄今为止人们对遗传水平的转录、翻译以及激素等调控因素的研究远未能阐明EVT对子宫内膜的“有控性侵袭”机制。　　目前，调控滋养细胞分化和发育的表观遗传学研究已成为滋养细胞研究领域的热点并取得较多成果[3]，但滋养细胞侵袭过程的表观遗传学研究依旧存在很多空白。究竟还有哪些基因受到表观修饰调控参与了滋养细胞的侵袭过程，调控表观修饰过程的关键酶，如：DNA甲基转移酶(DNA methyltransferasos，DNMTs)等在滋养细胞侵袭中作用如何，目前均知之甚少。本研究以此为出发点，从表观遗传角度，探索DNMTS表达和DNA甲基化修饰在滋养细胞侵袭中的调控作用，实验获得了如下结果：　　1.免疫组织化学实验分析不同DNMTs在不同分化类型滋养细胞中的表达分布，结果显示：正常胚胎绒毛中DNMT1在合体滋养细胞(STBs)中度表达，细胞滋养细胞(CTBs)低表达；DNMT3A在STBs低表达，CTBs高度表达；DNMT3B在STBs中度表达，CTBs中低表达。分化和侵袭行为均异常的完全型葡萄胎(complete hydatidiform mole，CHM)组织，DNMT1在STBs高度表达，CTBs中度表达。DNMT3A在STBs和CTBs均为中度表达；DNMT3B在STBs高度表达，CTBs中度表达。统计分析显示，在正常胚胎绒毛中，DNMT1在STBs的表达较CTBs中高，但无显著性差异(P=0.12)；DNMT3A在STBs中的表达远低于其在CTBs的表达，差别具有显著意义(P<0.01)；DNMT3B在STBs的表达较CTBs中高，但无显著性差异(P=0.23)。与正常胚胎绒毛相比：DNMT1(P<0.01)和DNMT3B(P<0.05)在完全型葡萄胎的STBs表达显著上调，DNMT3A表达下调，无显著性意义(P=0.21)；CTBs中DNMT1和DNMT3B表达上调但无显著性意义，DNMT3A表达显著下调(P<0.01)。　　定量PCR和Western blot实验分别从mRNA水平和蛋白水平验证了DNMTs在不同类型滋养细胞(组织)中的表达模式，即与具备一定分化和侵袭潜力的正常胚胎绒毛相比，几乎失去分化能力的完全型葡萄胎组织中，DNMT1和DNMT3B的表达显著上调，DNMT3A表达显著下调。上述结果揭示了不同DNMTs在滋养细胞分化或侵袭中可能发挥着不同的作用。　　2.在不同侵袭能力的体外培养的滋养细胞中，DNMTs表达亦具有差异：与具有较强侵袭能力的HTR-8/SVneo细胞相比，无论在mRNA还是蛋白水平，侵袭能力较低的绒癌来源细胞JEG-3中DNMT1表达均无显著性差异(P=0.15)；DNMT3A表达下调(P<0.05)；DNMT3B表达显著上调(P<0.01)。　　综合分析DNMTs的表达模式显示：在不同侵袭行为滋养细胞系中，DNMT1的表达并无显著差异，但在绒毛和完全型葡萄胎中的表达有显著差异；DNMT3A在侵袭能力较强的HTR-8/SVneo细胞和分化潜力强的胚胎绒毛中高表达；DNMT3B在侵袭能力较低的JEG-3和分化潜力较弱的完全型葡萄胎中高表达，说明DNMTs可能是影响滋养细胞分化和侵袭能力的重要因子，但在功能上有所差异。　　3.浓度分别为5μm/L和50μm/L的DNMTs抑制剂5-AZA-CdR诱导细胞，western blot检测该药物对DNMTs的表达抑制，结果显示DNMT1无显著性表达抑制；DNMT3A的表达抑制有显著性(P<0.01)，抑制倍数分别为0.28和0.26；对DNMT3B表达抑制亦较为显著(P<0.05)，抑制倍数分别为0.62和0.55。相同条件下，5-AZA-CdR对DNMT3A和DNMT3B表达的抑制能力有显著统计学差异(P<0.05)。5-AZA-CdR诱导下，HTR-8/SVneo细胞侵袭能力降低：药物处理组穿透细胞数量(7.3±1.3个/视野)与对照组穿透细胞数量(36.7±2.9个/视野)相比，有显著差异(P<0.01)。在调控滋养细胞侵袭能力方面，DNMT3A显示出比DNMT1和DNMT3B更为重要的作用。　　4.5-AZA-CdR诱导下，不同滋养细胞系在形态学改变、凋亡诱导等方面亦有所差异：HTR-8/SVneo细胞对药物诱导显示出一定的抵抗能力，JEG-3细胞则更为敏感。相同浓度和处理时间下，JEG-3细胞较HTR-8/SVneo细胞皱缩、变圆、及死亡脱落更为明显。JEG-3细胞凋亡数量(24.57±1.4％)高于HTR-8/SVneo细胞凋亡数量(10.23±1.04％)，药物诱导的凋亡细胞数量在两种细胞间具有显著差异(p<0.05)。说明DNMTs在不同滋养细胞中的表达可影响细胞对DNMTs抑制剂的敏感性。　　5.MeDIP-chip实验共发现8146个甲基化位点，其中正常胚胎绒毛，完全型葡萄胎，HTR-8/SVneo和JEG-3细胞系的启动子甲基化位点分别为4264个，4356个，6712和6395个(PeakScore≥2.0)，在22条常染色体和X染色体上均有分布。异常侵袭行为滋养细胞(完全型葡萄胎和绒癌)中甲基化，而同时在正常滋养细胞(正常胚胎绒毛和HTR-8)中非甲基化的位点涉及基因118个。正常滋养细胞(正常胚胎绒毛和HTR-8/SVneo)中甲基化、异常侵袭行为滋养细胞(完全型葡萄胎和绒癌)中同时为非甲基化的基因位点涉及基因88个。DAVID软件功能分类结果显示，存在差异甲基化位点的基因主要与细胞信号转导，磷脂的转运，细胞骨架组成，细胞周期，生殖过程等相关。　　6.MeDIP-chip实验所发现的差异甲基化基因，肿瘤蛋白D52(TPD52)、钙粘附蛋白(CDH1)、层粘连蛋白(LAMA4)等在不同滋养细胞系的差异甲基化模式被甲基化特异性PCR(MSP)证实；TPD52和CDH1的差异甲基化模式进一步被甲基化测序(BSP)实验所证实。RT-PCR显示，与JEG-3和JAR细胞相比，TPD52和CDH1基因的表达在HTR-8/SVneo细胞中受到了相对抑制。　　综上，本研究从表观遗传的角度探索了胚胎早期发育中EVTs侵袭的表观调控机制，获得了一些有意义的发现，这有可能为我们寻找EVT侵袭异常相关疾病的诊断靶点及防治开辟新的思路，并为寻求新的生殖调控手段提供重要线索。