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淋巴瘤(lymphoma)是起源于淋巴结或结外淋巴造血组织的免疫细胞恶性肿瘤,按病理类型一般分为非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma,NHL)和霍奇金淋巴瘤(Hodgkins lymphoma,HL)。淋巴瘤的发病率及死亡率呈逐年上升趋势;NHL的发病率远高于HL,是增长速度最快的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康。 EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)是发现最早的与人类恶性肿瘤有关的病毒,是一种普遍存在于人群中的嗜淋巴细胞的疱疹病毒,90％以上的成人血清中可检测到EBV抗体阳性。EB病毒基因组长172kb,为线性双链DNA病毒。此病毒能在淋巴细胞中潜伏感染,引起细胞增生和转化,EBV有潜伏感染和裂解感染两种形式,以潜伏感染最多见。潜伏循环中,EBV在被感染的细胞内不增殖,只表达小部分基因:3种潜伏膜蛋白、6种核抗原以及非翻译EBV编码的RNA。根据EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C基因序列的差异EB病毒可分为1型和2型,主要流行株为1型,其在体外转化B细胞的能力高于2型。 NK/T细胞淋巴瘤(Natural Killer/T cell lymphoma,NKTCL)是具有高度侵袭性的来源于自然杀伤(natural killer cell,NK)细胞的非霍奇金淋巴瘤,主要浸润结外器官,一般首先累及鼻腔或鼻咽部,以及其他部位如扁桃体、胃肠道、皮肤、睾丸等。依据肿瘤发生部位不同,NKTCL分为鼻腔NKTCL和鼻型NKTCL,肿瘤细胞以血管为中心浸润,往往伴有灶性坏死和血管的破坏。晚期患者往往存在凝血功能障碍及多器官功能衰竭,预后极差。NKTCL发病率居于T细胞淋巴瘤的首位,其发病具有显著地域差异,亚洲、南美洲国家及墨西哥较多,而欧美少见。许多研究表明,非霍奇金淋巴瘤中EB病毒的T细胞性淋巴瘤远远比EB病毒阳性的B细胞性淋巴瘤多,特别是结外NKTCL,EBV的阳性率可达95％,提示EBV在本病的发病中起着重要作用。 目的： 鉴定本实验室保存的NK细胞系感染EB病毒的1或2亚型;探究EBV能否在体外感染NK细胞,为探索EB病毒在NK/T细胞淋巴瘤发生发展中的机制作铺垫。 方法： 1.常规PCR鉴定NK细胞系各细胞株感染EB病毒1或2亚型:提取本实验室保存的NK细胞系各细胞株DNA,根据EBNA-3C特异性编码序列区的设计引物,采用常规PCR方法鉴定各NK细胞系感染EB病毒1、2亚型。 2.从B95-8细胞培养液上清中提取EB病毒,感染NKL细胞。实验分组:①实验组(E-NKL组):取1×106个细胞,800rpm离心5min,弃上清液;用浓缩100倍的EB病毒液0.5ml重悬淋巴细胞;重悬的的细胞放入37℃水浴锅中2h,每30min摇匀一次。恒温水浴2h后,将NKL细胞移入到六孔板中,加入2ml含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液,48小时后收集各组细胞进行检测。②对照组(NKL组):不加EB病毒液,以相同方式培养。 3.常规PCR法检测EBNA-1和LMP-1基因:提取实验组和对照组细胞DNA,设计引物,运用常规PCR方法,琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析仪检测结果。 4.Western blot法检测实验组和对照组EBNA-1和LMP-1蛋白表达。 5.观察并记录EBV感染前后细胞形态的变化:镜下观察实验组及对照组NKL细胞形态学变化,主要观察细胞的大小、形状、透明度及聚集情况。 6.Annexin V法检测NKL细胞凋亡:收集感染48h和72h后的各组细胞,应用Annexin V-FICT法检测各组NKL细胞的凋亡,并对比。 7.应用软件SPSS21.0进行绘图及统计学分析,数据用平均值±标准差表示。两组不同数据比较若其方差齐,应用t检验,如方差不齐,应用t检验。P＜0.05差异有统计学意义。 结果： 1.NK细胞系各细胞株中YTS、YT、NKYS、SNK、KAI3均为1型EBV感染,NKL、NK92为EBV阴性。 2.EBV能够引起NKL细胞潜伏感染:提取感染48小时后各组细胞基因组DNA,常规PCR结果显示实验组EBNA-1基因为阳性,对照组为阴性,而LMP-1在两组中均为阴性。Western blot法在实验组中检测出EBNA1蛋白的表达,LMP-1蛋白在两组中均为阴性。 3.EBV感染引起NKL细胞凋亡:实验组细胞随着时间延长,逐渐表现为形态不规则,体积大小不一,胞质破裂溶解,培养第7天后细胞几乎全部死亡,对照组细胞未见明显变化。Annexin V法检测实验组培养48h和72h后NKL细胞的凋亡率分别为(12.16±2.36)％、(45.25±5.42)％(P值分别为0.020,0.001),培养72h后感染组细胞的凋亡率明显增加。 结论： 1.NK细胞系各细胞株中以1型EBV感染为主,NKL和NK92为EBV阴性。 2.EB病毒能够体外潜伏感染NK细胞。