目的:镉（Cadmium,Cd）是存在于自然环境中的有毒过渡性重金属元素,广泛应用于电池、颜料、涂料、镀层和塑料稳定剂中。除了职业暴露外,吸烟和饮食是大多数人镉暴露的主要来源。动物实验与流行病学证据均显示,镉暴露严重影响神经系统结构与功能。突触是连接大脑神经元的结构,是学习和记忆的关键结构。中枢神经系统的主要免疫细胞--小胶质细胞,是大脑突触调节的重要参与者,它可通过对突触修剪（吞噬作用）在学习记忆功能中发挥重要作用。此外,已有研究表明在不良内外环境作用下小胶质细胞可分泌炎症因子并进行异常的吞噬作用,导致神经突触的损害乃至丧失。补体受体途径（C3-CR3）与趋化因子途径（CX3CL1-CX3CR1）（简称为“吃我”信号）介导小胶质细胞对突触的吞噬作用。海马脑区是神经系统中负责学习记忆的关键脑区,故研究海马区的小胶质细胞在镉作用下的变化对理解其导致的神经元及学习记忆能力损伤有重要意义。慢性炎症反应可能是镉暴露所致脑损伤的主要毒性机制。已有研究显示,作为神经系统的慢性炎症的重要参与者,小胶质细胞可被镉暴露诱导活化。但是,活化后的小胶质细胞是否通过分泌炎症因子或吞噬作用在镉诱导神经系统损伤的过程中发挥作用以及其作用机制目前尚未阐明。氧化还原稳态的守卫者核转录因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,NFE2L2,又称Nrf2）是内源性诱导防御系统的关键调节因子。Nrf2参与调控细胞内氧化-还原稳态、重金属应激反应、炎症反应和毒物的代谢解毒等生理病理过程。Nrf2在中枢神经系统中的保护作用被广泛证明,但是其具体作用机制与发挥作用的主要细胞类型仍不明晰。因此本研究首先应用全身Nrf2敲除的小鼠,观察亚慢性镉暴露对其神经系统损伤的影响;其次分别在体外稳定沉默了神经元与小胶质细胞中的Nrf2基因,明晰Nrf2在镉导致的神经损伤过程中发挥主要功能的细胞类型以及具体病理过程;最后采用小胶质细胞与神经元共培养模型,阐明小胶质细胞在镉暴露所致神经元突触损伤中的具体作用（炎症因子分泌过量和/或吞噬作用）及可能机制。研究方法:1、研究Nrf2在镉暴露致小鼠学习记忆损伤以及小胶质细胞异常活化中的作用:应用野生型以及全身Nrf2敲除的小鼠,分别设立对照组与亚慢性镉暴露组。其中镉暴露组以自由饮水的方式暴露于100 ppm的Cd Cl2 24周。在整个实验过程,监测小鼠体重、饮食以及饮水情况。在染毒第24周进行旷场试验、T迷宫实验和莫里斯水迷宫实验检测各组小鼠的学习记忆能力。待行为学结束后,用高纯度CO2窒息处死小鼠并根据后续实验需要进行取材。采用电感耦合等离子体质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）法检测各组小鼠海马组织镉含量;采用高尔基染色法检测各组小鼠海马脑区神经元树突以及树突棘变化;采用RT-q PCR法检测各组小鼠海马组织氧化应激及炎症反应的经典基因的转录水平;采用Western Blot法检测各组小鼠海马组织突触相关蛋白、NFκB/IκB-α信号通路相关蛋白、小胶质细胞活化标志物的表达情况;采用免疫荧光法检测树突微管相关蛋白的表达以及小胶质细胞的密度和形态。2、应用神经元及小胶质细胞系和原代培养神经元研究Nrf2在镉致神经元损伤中的作用及其在镉致小胶质细胞活化中的作用与机制:分别在体外建立Nrf2基因稳定沉默HT22小鼠海马神经元镉暴露模型、Nrf2基因稳定沉默BV2小鼠小胶质细胞镉暴露模型、抑制Nrf2表达的原代小鼠神经元镉暴露模型。采用CCK8检测BV2与HT22细胞活力并采用RT-q PCR法检测两种细胞Nrf2下游基因的m RNA表达;采用Western Blot法检测原代小鼠神经元突触相关蛋白的变化;采用RT-q PCR法检测BV2细胞抗氧化典型基因、镉代谢相关酶基因、炎症反应的经典基因的转录水平;采用Western Blot法检测BV2细胞抗氧化蛋白、NFκB/IκB-α信号通路相关蛋白、小胶质细胞活化标志物的表达情况;采用FM1-43染料内吞实验检测BV2细胞胞吞能力变化;采用划痕伤口愈合试验检测BV2细胞迁移能力的变化;采用luminex液相芯片技术检测BV2细胞炎症因子分泌情况;采用免疫荧光法检测BV2细胞NFκB蛋白入核表达情况、小胶质细胞标志物CD68与Iba1蛋白表达情况。应用米诺环素（Minocycline,Mino）,采用免疫荧光、RT-q PCR、Luminex和Western Blot实验方法检测其对镉所致小胶质细胞活化的抑制情况。3、研究小胶质细胞活化在镉致神经元突触损伤中的作用与机制:应用研究方法1中的野生型以及全身Nrf2敲除的小鼠建立亚慢性镉暴露模型,并在体外分别建立:原代小鼠神经元镉暴露模型;小胶质细胞与神经元的接触共培养模型;小胶质细胞获得的条件培养基与神经元共培养模型。采用鬼笔环肽荧光染色与免疫荧光染色分析神经元树突棘变化;采用免疫荧光染色与Western Blot法分析神经元突触相关蛋白的表达;采用免疫荧光共定位分析小胶质细胞对神经元突触的吞噬作用;采用Western Blot法分析小胶质细胞与神经元“吃我”信号通路相关蛋白C3-CR3与CX3CL1-CX3CR1的表达。结果:1、Nrf2基因缺失对镉所致的小鼠学习记忆功能损伤的影响1.1亚慢性镉暴露增加小鼠海马组织镉含量。亚慢性镉暴露后,Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠海马组织中的镉含量均显著增加,但Nrf2-WT组与Nrf2-KO组之间镉含量没有统计学差异。1.2 Nrf2缺失可加剧镉诱导的小鼠海马氧化应激。亚慢性镉暴露后,Nrf2-WT小鼠海马组织的Nrf2、Gclc和Hmox1基因的m RNA表达显著增加。然而,Nrf2-KO小鼠Gclc、Gclm和Hmox1的表达水平没有显著变化。此外亚慢性镉暴露后两种基因型小鼠海马组织中8-OHd G表达均增加,但是Nrf2-KO小鼠比Nrf2-WT小鼠8-OHd G表达增加的更多。1.3 Nrf2缺失会加重镉导致的小鼠学习记忆损伤。水迷宫定位航行训练实验阶段结果显示亚慢性镉暴露后Nrf2-KO小鼠与Nrf2-WT小鼠的逃避潜伏期增加（P＜0.05）。空间探索实验阶段结果显示各组小鼠之间的游泳速度没有显著差异。亚慢性镉暴露后Nrf2-KO组与Nrf2-WT组小鼠首次到达隐藏平台的时间明显增加（P＜0.01和P＜0.05）,穿越隐藏平台区域的次数与在隐藏平台花费的时间明显减少（P＜0.01和P＜0.05）。亚慢性镉暴露后Nrf2-KO组小鼠在目标象限花费的时间明显减少（P＜0.05）,首次到达目标象限的时间明显增加（P＜0.05）。值得注意的是亚慢性镉暴露后Nrf2-KO组小鼠首次到达隐藏平台的时间与首次到达目标象限的时间明显多于Nrf2-WT组小鼠（P＜0.05）。旷场试验结果显示各组小鼠之间的运动速度没有变化,亚慢性镉暴露后Nrf2-KO小鼠与Nrf2-WT小鼠在旷场中心花费的时间明显降低（P＜0.05）。T迷宫实验结果显示亚慢性镉暴露后Nrf2-KO小鼠的自发交替选择次数明显降低（P＜0.05）。2、Nrf2基因缺失对镉所致的小鼠神经元结构损伤的影响2.1 Nrf2缺失会加重镉导致的小鼠树突损伤。MAP2免疫荧光染色实验结果显示亚慢性镉暴露后两种基因型小鼠海马组织CA1区与DG区MAP2表达均降低,但是Nrf2-KO小鼠比Nrf2-WT小鼠MAP2降低的更多。采用Golgi染色实验分析海马CA1区与DG区神经元树突长度与分支复杂性,结果显示亚慢性镉暴露降低了两种基因型小鼠的树突长度与分支复杂度（P＜0.05）,并且Nrf2-KO小鼠比Nrf2-WT小鼠降低的更多（P＜0.05）。2.2 Nrf2缺失会加重镉导致的小鼠树突棘损伤。采用Golgi染色实验分析海马CA1区与DG区神经元树突棘密度与形态,结果显示亚慢性镉暴露后,两种基因型小鼠的总树突棘密度均显著降低,不成熟树突棘密度增加（P＜0.05）。此外亚慢性镉暴露后Nrf2-KO小鼠比Nrf2-WT小鼠成熟树突棘密度降低得更多（P＜0.05）。2.3 Nrf2缺失会加重镉导致的小鼠海马突触相关蛋白表达降低。Western Blot结果显示在亚慢性镉暴露后,小鼠海马组织突触相关蛋白PSD95与SYN蛋白表达均显著降低（P＜0.05）,而且Nrf2-KO小鼠比Nrf2-WT小鼠PSD95蛋白表达更低（P＜0.05）。3、Nrf2缺失对镉所致的小鼠小胶质细胞活化与炎症反应的影响3.1 Nrf2缺失会增加镉导致的小鼠小胶质细胞活化与炎症反应。Iba1免疫荧光染色显示亚慢性镉暴露后小鼠海马组织CA1区与DG区小胶质细胞密度均增加,但是Nrf2-KO小鼠比Nrf2-WT小鼠增加的更多。小胶质细胞形态分型结果显示,亚慢性镉暴露后,两种基因型小鼠分支形态的小胶质细胞百分比均显著降低,而变形虫形和圆形小胶质细胞的百分比均显著增加。此外,在亚慢性镉暴露后,Nrf2-KO小鼠比Nrf2-WT小鼠显示出更低比例的分支形小胶质细胞与更高比例的圆形小胶质细胞（P＜0.05）。通过RT-q PCR法检测了各组小鼠海马组织炎症因子典型基因的表达情况,结果显示亚慢性镉暴露后两种基因型小鼠海马组织经典炎症因子的m RNA转录水平显著增加,但是Nrf2敲除小鼠的转录水平高于野生型小鼠（P＜0.05）。采用Western Blot实验检测各组小鼠海马组织NFκB/IκB-α信号通路相关蛋白的表达,结果显示亚慢性镉暴露后两种基因型小鼠海马组织中p-IκB-α与p-NFκB蛋白表达均显著增加,但是Nrf2敲除小鼠的蛋白增加的水平高于野生型小鼠（P＜0.05）。此外,亚慢性镉暴露后Nrf2敲除小鼠的IκB-α蛋白水平显著降低（P＜0.05）。免疫荧光染色与Western Blot实验均显示亚慢性镉暴露后两种基因型小鼠海马组织中CD68的表达均增加,但是Nrf2-KO小鼠比Nrf2-WT小鼠增加的更多（P＜0.05）。4、Nrf2稳定沉默或抑制对体外培养的小胶质细胞及神经元氧化应激水平及细胞活力的影响4.1 Nrf2稳定沉默对未染毒的BV2细胞与HT22细胞氧化应激经典基因的转录水平影响。在BV2小胶质细胞中,Nrf2沉默后其下游基因Gclc、Gclm、Hmox1和Nqo1的m RNA水平也显著低于BV2-Scramble细胞（P＜0.05）。然而,在HT22海马神经元细胞中,Nrf2沉默并未影响其下游的基因表达水平。4.2 Nrf2稳定沉默后镉暴露对BV2与HT22细胞活力的影响。暴露于浓度大于1μM的镉时,BV2细胞的细胞活力随着镉浓度的增加,逐渐降低（P＜0.05）,并且BV2-Nrf2-KD细胞的细胞活力显著低于相同镉浓度处理的BV2-Scramble细胞。暴露于浓度大于4μM的镉时,HT22细胞的细胞活力随着镉浓度的增加,逐渐降低（P＜0.05）,在每个镉浓度下,HT22-Scramble细胞和HT22-Nrf2-KD细胞之间的细胞活力均没有显著差异。4.3 Nrf2抑制剂对镉暴露后原代小鼠神经元的影响。当暴露于大于10μM浓度的镉时,原代神经元细胞活力显著降低（P＜0.05）,并且Nrf2抑制剂并不影响镉处理后原代神经元的细胞活力。Western Blot实验显示5μM镉显著降低了原代神经元中PSD95与SYN蛋白表达（P＜0.05）,Nrf2抑制剂并不影响神经元中PSD95与SYN蛋白表达水平5、Nrf2稳定沉默对镉暴露后小胶质细胞活化及炎症反应的影响5.1 Nrf2稳定沉默加重了镉暴露BV2小胶质细胞中氧化应激与炎症反应。BV2-Scramble小胶质细胞经镉处理后抗氧化典型基因与镉代谢相关酶基因表达显著增加（P＜0.05）,镉处理的BV2-Nrf2-KD小胶质细胞抗氧化典型基因与镉代谢相关酶基因表达较镉处理的BV2-Scramble小胶质细胞明显降低（P＜0.05）。BV2小胶质细胞经镉或LPS处理后,迁移能力与吞噬能力均明显升高,但BV2-Nrf2-KD小胶质细胞升高的更加明显（P＜0.05）。Western Blot实验结果显示镉暴露后BV2小胶质细胞的NFκB/IκB-α信号通路被激活,免疫荧光实验结果显示NFκB入核表达增加,这一情况在BV2-Nrf2-KD小胶质细胞中更加明显。RT-q PCR实验结果显示镉暴露后BV2小胶质细胞的炎症因子典型基因的表达显著增加,Luminex实验结果显示镉暴露后BV2小胶质细胞培养基上清的炎症因子蛋白分泌增加。炎症因子典型基因的表达与蛋白分泌在BV2-Nrf2-KD小胶质细胞中增加的更加明显。5.2 Mino抑制镉所致的BV2小胶质细胞活化。Mino干预降低了镉处理后BV2-Scramble细胞中CD68的表达（P＜0.05）,降低了镉处理后BV2-Scramble细胞中炎症因子典型基因的表达和培养基上清炎症因子的分泌（P＜0.05）,降低了镉处理对NFκB/IκB-α信号通路的激活作用。但是在镉处理的BV2-Nrf2-KD细胞中,Mino干预并未起到预期效果。6、镉致小胶质细胞异常活化损伤突触的途径6.1亚慢性镉暴露小鼠海马中小胶质细胞对突触的吞噬作用。免疫荧光实验显示,亚慢性镉暴露后,与小胶质细胞胞体共定位的突触素SYN表达增加,Nrf2-KO小鼠比Nrf2-WT小鼠增加的更多。Western Blot实验结果显示亚慢性镉暴露后Nrf2-WT小鼠CX3CR1蛋白表达增加（P＜0.05）,Nrf2-KO小鼠CX3CL1、CX3CR1、C3和CR3蛋白的表达增加（P＜0.05）。此外亚慢性镉暴露后Nrf2-KO小鼠CX3CL1、CX3CR1与C3蛋白的表达显著高于Nrf2-WT小鼠。6.2镉暴露对体外单独培养神经元突触的影响。5μM和10μM的镉处理可导致原代培养神经元的树突棘密度降低,突触相关蛋白SYN表达降低（P＜0.05）。5μM的镉处理显著降低了HT22海马神经元细胞突触相关蛋白PSD95和SYN以及树突微管相关蛋白MAP2的表达水平（P＜0.05）。6.3小胶质细胞活化加重了镉所致培养神经元的突触损伤。在BV2小胶质细胞与神经元接触共培养模型中,我们发现镉处理可导致小胶质细胞对原代神经元突触结构的吞噬作用增强,并显著降低HT22海马神经元细胞系中突触相关蛋白的表达（P＜0.05）。在BV2-HT22接触共培养模型中“吃我”信号相关蛋白显著增加（P＜0.05）。在从BV2小胶质细胞获得的条件培养基与神经元共培养模型中,我们发现从镉处理获得的BV2小胶质细胞条件培养基会引起原代神经元树突棘密度减少（P＜0.05）,突触相关蛋白的表达降低。在此基础上,我们的实验结果进一步证实小胶质细胞中的Nrf2缺失加重了小胶质细胞活化,从而加重小胶质细胞-神经元接触共培养与小胶质细胞条件培养基-神经元共培养模型中镉所致的神经元突触损伤。Mino可通过抑制BV2-Scramble小胶质细胞活化减轻镉所致体外培养神经元的突触损伤。结论:1.Nrf2基因缺失加重了镉所致的小鼠学习记忆损伤以及树突-树突棘和突触的损伤。2.Nrf2基因缺失加重了镉所致的小胶质细胞活化与炎症反应,这可能是上述Nrf2基因缺失加重镉所致的神经损害的原因之一。3.Nrf2基因沉默加重了镉所致的小胶质细胞活化进而损伤神经元突触,这可能是通过小胶质细胞直接吞噬作用与炎症因子分泌过多两方面造成的。而补体受体途径（C3-CR3）与趋化因子途径（CX3CL1-CX3CR1）均参与了小胶质细胞的直接吞噬作用。