家蚕（Bombyx mori）是重要的经济昆虫,家蚕氟中毒对蚕业的发展造成了巨大的经济损失,阐明家蚕氟中毒的机理具有重要的理论意义和实践价值。GADD45蛋白家族参与生物许多重要的生命过程,包括细胞生长与衰老、细胞凋亡、DNA损伤、氧化应激反应。目前,GADD45蛋白家族在人类、小鼠及果蝇中的研究较为深入,而在家蚕中关于GADD45的研究甚少。有研究发现家蚕氟中毒之后,GADD45α基因的表达量显著升高。因此我们对家蚕BmGADD45α进行了研究,克隆家蚕BmGADD45α的开放阅读框序列,并对其编码的蛋白质进行表达,利用荧光定量PCR、个体干涉、Western Blot等技术手段对BmGADD45α进行克隆鉴定和功能研究,为探究家蚕氟中毒的具体机制打下基础,主要的研究结果如下:1.BmGADD45α基因的克隆与生物信息学分析根据转录组分析和序列比对得到家蚕BmGADD45α基因的预测序列,以大造的c DNA为模板对BmGADD45α的编码区进行克隆验证。利用生物信息学软件对BmGADD45α进行分析,该基因完整的编码区全长495 bp,编码164个氨基酸,蛋白分子量为18.34 k Da。等电点为5.34,分子式为C810H1289N211O244S14。稳定系数为53.71（不稳定）,脂肪系数为92.13,无信号肽,无跨膜结构域,该蛋白含有Ribosomal-L7Ae结构域,符合GADD45蛋白家族典型特征。二级结构和三级结构预测可知该蛋白α螺旋和无规卷曲所占比例较高。2.BmGADD45α蛋白水平上的表达分析通过生物信息学分析发现BmGADD45α蛋白不具有信号肽也没有跨膜区,所以设计引物连接到原核表达载体pet B2M上,转化至大肠杆菌表达系统中,在30℃,IPTG终浓度为0.5 m M的条件下诱导表达4 h,成功表达出重组蛋白。纯化出纯度>85%的重组蛋白,制备多克隆抗体,利用间接ELISA方法检测抗体效价大于1:50000。利用制备得到的抗体进行Western Blot实验,检测BmGADD45α蛋白在家蚕各组织中的表达情况。结果发现BmGADD45α蛋白在脂肪体中表达量最高,在其他各组织中也有不同程度的表达。推测与脂肪体的功能及家蚕的变态发育有关,而脂肪体又是家蚕重要的解毒器官之一,家蚕氟中毒可能与脂肪体中BmGADD45α发挥的功能相关。3.BmGADD45α的功能研究喂食家蚕不同浓度Na F浸泡过的桑叶后,通过荧光定量PCR检测,与对照组相比,家蚕氟中毒后BmGADD45α的表达量升高;细胞凋亡、压力、应激相关通路基因Bm P38、Bm P53、Bm Fox O的表达量升高;细胞周期抑制相关通路基因Bm Cdc2、Bm Cyclin B1、Bm P21的表达量下降;DNA修复相关通路基因Bm PCNA的表达量升高,但是Bm BRCA1的表达量下降。通过过表达载体,对BmGADD45α基因进行过表达。并对Bm N细胞添加Na F,使Na F的终浓度为1 m M、3 m M、5 m M,观察细胞生长状态。荧光定量PCR检测BmGADD45α的表达量升高,细胞凋亡、压力、应激相关通路基因Bm P38、Bm Fox O的表达量升高,Bm P53无显著变化;细胞周期抑制相关通路基因Bm Cdc2、Bm Cyclin B1、Bm P21的表达量下降;DNA修复相关通路基因Bm PCNA的表达量升高,但是Bm BRCA1的表达量下降。通过Western Blot检测家蚕氟中毒之后BmGADD45α蛋白的表达变化情况,BmGADD45α蛋白在家蚕氟中毒之后表达量升高,与m RNA水平上BmGADD45α基因的变化趋势一致。4.家蚕BmGADD45α在个体上的干涉研究通过RT-PCR和q PCR检测了BmGADD45α基因在家蚕各组织和各时期的表达情况,结果发现BmGADD45α在家蚕的各组织中都有表达,在脂肪体中的表达量最高;在预蛹期之后BmGADD45α一直保持较高量的表达。合成BmGADD45α的双链,选取预蛹期家蚕进行注射,利用q PCR检测BmGADD45α及相关通路基因的表达变化。并观察蛹期的变化。细胞凋亡、压力、应激相关通路基因Bm P38、Bm P53、Bm Fox O的表达量下降;细胞周期抑制相关通路基因Bm Cdc2、Bm Cyclin B1、Bm P21的表达量上升;DNA修复相关通路基因Bm PCNA的表达量下降,但是Bm BRCA1的表达量上升。与细胞水平上的研究结果一致。对干涉后家蚕进行表型观察,与对照组相比,干涉组的存活率降低了10%左右;延迟化蛹数量明显增多,经石蜡切片、HE染色之后观察脂肪体重塑过程,发现干涉之后脂肪体的重塑推迟,导致化蛾延长。