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目的:血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是高侵袭性的肿瘤细胞所具有的自我血供的微循环结构,利用人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3分离培养3种不同形态的单细胞克隆,比较其体内成瘤能力及体外克隆形成能力,并计算克隆形成率(colony forming efficiency,CFE);观察其形成VM的能力;并检测肿瘤干细胞标记物CD133和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9的表达水平。方法:1通过有限稀释法对SKOV3进行单细胞培养形成3种不同形态的单细胞克隆:全克隆(holoclone)、部分克隆(meroclone)、亚克隆(paraclone);Holoclone细胞紧密排列体积小,圆形或椭圆形,具有连续传代、无限增殖等干细胞特性;Paraclone细胞形状不规则,松散,可能为终末分化细胞;Meroclone介于holoclone和paraclone之间。取对数生长期的SKOV3细胞,用梯度倍数稀释的原则,将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度(每个96孔板中含0.5-1个细胞)。次日,挑选并标记只含1个细胞的孔;培养10-14天后孔中即形成较大克隆,区分并标记各种形态不同的细胞克隆。继续培养进行细胞后续实验。实验重复3次。2体内成瘤能力的试验:将30只雌性裸鼠(BALB/c-nu)随机分成3组分别接种3种不同形态的细胞。无菌条件下,将holoclone细胞计数1000个,meroclone细胞和paraclone细胞计数分别为1×105个,分别重悬于0.2ml PBS中,接种于裸鼠右侧大腿皮下,观察裸鼠皮下成瘤情况。实验重复3次。3软琼脂克隆形成实验:制备单细胞悬液,将holoclone,meroclone,paraclone分别接种在软琼脂上,培养箱内培养2~3周。镜下计数含50个细胞以上的克隆,并计算CFE。实验重复3次。4三维细胞培养:将holoclones细胞,meroclones和paraclones细胞分别接种于用于进行三维细胞培养的人工基底膜基质胶Matrigel上。利用倒置相差显微镜随机取上、下、左、右、中心5个视野,间隔相同的时间观察VM形成情况,并拍照记录。实验重复3次。5 Western Blot方法检测MMP-2、MMP-9和CD133的表达。实验重复3次。结果:1细胞单克隆的筛选将SKOV3细胞利用有限稀释法将稀释的细胞接种于96孔板。接种24 h后,挑选并标记只含有1个细胞的孔。继续培养10-14d后,区分细胞克隆的形态及分类并计数(此部分实验由两个人进行确认)。Holoclone细胞均呈圆形或椭圆形,细胞密集整齐排列,形态规则,其所含的细胞体积小,胞浆较少,无明显伪足或突起。Paraclone细胞形状不规则,松散,体积也较大,细胞含有丰富的胞浆,可见明显伪足或突起。Meroclone形态位于holoclone和paraclone中间,不如holoclone规则,内部的细胞排列相对均匀,体积也较小,细胞排列趋向松散,周边的细胞可以出现伪足。本实验重复3次,计算3种克隆的平均比例,holoclone为17.4±0.8%,meroclone为30.1±0.4%,paraclone为52.5±1.1%。在相同培养条件下,观察10周左右,holoclone可以快速增殖,连续传代,meroclone及paraclone大部分消失。观察12周左右,holoclone仍保持快速增值,可以连续传代,仅存的小部分meroclone及paraclone全部发生凋亡或无法继续传代。观察16周左右holoclone的形态与母系SKOV3细胞形态相似,呈对数生长。后续实验均使用培养12周之前的细胞。2体内成瘤能力的分析将1000个holoclone细胞接种于雌性裸鼠大腿皮下,观察7-10天后,平均成瘤率为80%。将1×105个meroclone细胞接种于雌性裸鼠大腿皮下,持续观察6周后,未见雌性裸鼠成瘤。将1×105个paraclone细胞接种于雌性裸鼠大腿皮下,持续观察6周后,未见雌性裸鼠成瘤。3克隆形成率软琼脂克隆形成实验结果:Holoclone细胞CFE为16.7±3.8%;meroclone细胞CFE为6.5±1.5%;但paraclone细胞CFE非常低,仅仅为1.2±0.7%(P<0.05)。Holoclone细胞CFE比meroclone细胞和paraclone细胞CFE约增加二倍至十倍。4三种单细胞克隆形成VM的能力在三维细胞培养条件下,holoclone在6 h即形成典型的VM管状样结构,12 h达到高峰,72 h后此结构开始松散凋落。然而meroclone和paraclone未形成VM。5 Western blot方法检测CD133及MMP-2、MMP-9的蛋白表达Holoclone组CD133蛋白表达水平显著高于母系SKOV3组,同时也高于meroclone和paraclone组(P<0.05 F=33.524)。Holoclone组MMP-2蛋白表达水平显著高于母系SKOV3组,同时也高于meroclone和paraclone组(P<0.05 F=11.641)。Holoclone组MMP-9蛋白表达水平显著高于母系SKOV3组,同时也高于meroclone和paraclone组(P<0.05 F=14.336),差异有统计学意义。结论:1人卵巢癌细胞系SKOV3中不同单细胞克隆在形态和分化上存在异质性,其中holoclone细胞具有较高的体内成瘤率及体外克隆形成率,且高表达CD133,具有肿瘤干细胞样细胞特性。2 Holoclone具有形成VM能力,为卵巢恶性肿瘤的转移及复发提供充足的血液供应,其机制可能与MMPs诱导细胞外基质重塑及肿瘤的高侵袭力有关,有助于深入理解卵巢癌侵袭及复发的机制。