目的 研究角膜新生血管周围间质微环境与新生血管生长之间的关系，进一步探讨角膜新生血管的发生机制。 方法 (一)研究角膜新生血管形成时周围间质微环境的改变 1、建立不同形式的碱烧伤角膜新生血管动物模型(1)单纯碱烧伤角膜新生血管模型：选用Wister大鼠8只，将直径3mm单层圆形滤纸片浸于1mol/LNaoH溶液中15s，滤纸吸出多余的溶液，贴于右眼角膜中央2min，取下滤纸，无菌生理盐水冲洗1min。(2)板层角膜移植层间新生血管模型：Wister大鼠24只为受体，SD大鼠为供体，建立同种异系板层角膜移植层间新生血管动物模型。随机分为4组，每组6只，均为右眼手术。3.0mm环钻于Wister鼠角膜中央钻切，深度达1/3-1/2角膜时，使用尖刀片剥除板层角膜，制作板层角膜植床。3.5mm环钻取SD鼠角膜，制作角膜植片，10-0尼龙线间断缝合8针于已剥除板层角膜的植床。A组：单纯剥除角膜内皮制作角膜植片。B组：手术方法同A，植片缝合前，将直径3mm浸有1mol/LNaoH滤纸片置于角膜植床中央20s，取下滤纸，生理盐水冲洗30s。C组：角膜植片为从SD大鼠角膜剥下的板层角膜植片。D组：板层角膜植片联合NaoH滤纸片烧灼。术后定期观察照相及行组织病理学检查。 2、免疫组织化学方法检测角膜新生血管周围间质的改变碱烧伤Wister大鼠6只，术后3、5、7天分别处死2只，取角膜。板层角膜移植Wister大鼠2只，术后15天处死，取角膜。正常Wister大鼠2只，处死取角膜，作为正常对照组。冰冻切片，免疫荧光法检测两种新生血管模型中TGF-β1(转化生长因子-β1)、a-SMA(a-平滑肌肌动蛋白)、FAP(成纤维细胞激活蛋白)的表达情况并观察它们与新生血管之间的关系。以CD31(血小板内皮细胞粘附因子)标记血管内皮细胞。 3、分子生物学方法验证FAP的表达采用RT-PCR方法检测FAP在角膜中不同时间及位置的表达。制作4只Wister大鼠右眼碱烧伤血管模型，术后第3、7天分别处死2只。首先使用3.0mm环钻取中央碱烧伤角膜(A区)，然后角巩膜剪剪下周边角膜(B区)。对比正常角膜及不同时间AB区FAP的表达情况。 4、苦味酸天狼猩红—偏振光法检测角膜间质中主要胶原的改变取正常大鼠角膜、碱烧伤后7天角膜、板层角膜移植术后15天角膜，石蜡切片，行苦味酸天狼猩红染色后，应用偏振光显微镜观察新生血管角膜中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的变化。 5、超微结构检查取碱烧伤5天及板层角膜移植术后15天的角膜，行透射电镜检查，观察角膜新生血管形成时间质的改变。 (二)间质靶分子(FAP)诱导新生血管的研究 大鼠角膜基质注射FAP，观察是否可以诱导角膜新生血管。将18只Wister大鼠随机分为A、B、C三组，每组6只，均行右眼角膜基质注射。A空白对照组注射生理盐水，5ul；B组注射10ng/ulFAP，5ul；C组注射100ng/ul的FAP，5ul。术后，定期观察，记录新生血管积分，进行统计学分析。 结果 (一)角膜新生血管形成时周围间质微环境的改变 1、动物模型的建立：(1)碱烧伤组：烧伤后1天内可见角膜缘血管网扩张充血，第3天时NV已经侵入角膜，第7～14天达到生长旺盛期，长入角膜中央，之后血管开始逐渐退缩。病理检查见血管生长，炎性细胞浸润。(2)板层角膜移植组：单纯剥除角膜植片内皮的全厚板层角膜移植联合植床碱烧伤的方法成功制作出了层间新生血管模型，术后1天内可见角膜缘血管网扩张充血，第3天时NV已经侵入角膜，第7天血管生长到达植片与植床的连接处，15天左右层间新生血管最为旺盛。病理检查见层间血管生长，炎性细胞浸润。 2、免疫组织化学方法检测角膜新生血管周围间质的改变碱烧伤后7天及板层角膜移植术后15天的角膜冰冻切片免疫荧光双染显示：两种新生血管动物模型角膜内均含有a-SMA、FAP同时阳性的细胞，对照正常角膜无阳性表达。FAP+基质细胞位于CD31+的血管内皮细胞周围，与血管内皮细胞伴行生长，两者无明显的先后顺序。同时免疫荧光显示角膜间质TGF-β1阳性表达。 3、分子生物学方法验证FAP的表达RT-PCR结果显示，正常角膜内不含有FAP，碱烧伤3天A区角膜，不含有FAP；碱烧伤3天B区角膜，出现FAP。碱烧伤7天A区角膜，表达FAP；碱烧伤7天B区角膜，表达FAP。新生血管生长到达的位置，出现FAP阳性表达。 4、苦味酸天狼猩红—偏振光法检测角膜间质中主要胶原的改变正常大鼠角膜以Ⅰ型胶原含量最多，折射率强，偏光镜下呈亮黄、橙或红色粗纤维状；Ⅲ型胶原，折射率弱，偏光下为细长的绿色纤维。角膜新生血管生长后Ⅰ型、Ⅲ型胶原重新排列以适应新生血管的生长。 5、超微结构观察透射电子显微镜下，碱烧伤角膜内新生血管生长，炎性细胞浸润；板层角膜移植层间新生血管生长，炎性细胞浸润。血管内皮细胞周围被另外一种细胞包绕。 (二)间质靶分子诱导新生血管的研究 A组术后3天角膜缘血管扩张充血，7天时无新生血管长入角膜；B组术后3天角膜缘血管扩张充血，7天时新生血管开始向注药区域生长，14天时长入注药区域；C组术后3天注药区域角膜缘有新生血管长入，7天时有大量新生血管向注药区域生长，14天时大量新生血管长入注药区域。角膜基质注射后5天、7天、14天时三组之间角膜新生血管积分差别均有显著性，P＜0.05。由此推测FAP可以诱导角膜新生血管生长，而且存在一定的量效关系。 结论 角膜新生血管形成时，血管周围间质微环境发生了改变，出现了FAP+的基质细胞，此细胞包绕并伴随血管内皮细胞生长。角膜新生血管周围间质微环境很可能与新生血管的生长关系密切。