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O-连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-Linked N-acetylglucosamine,O-Glc NAc)是一种广泛存在于蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上的蛋白质翻译后修饰方式,与磷酸化相似,参与调节多种细胞途径,并与癌症、糖尿病、神经退行性疾病等疾病的发病机理密切相关。与磷酸化不同,真核细胞内几千种蛋白质的O-Glc NAc动态修饰仅由N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)两种酶协同完成,它们的调节机制在生命科学领域一直受到广泛关注,但是至今相关研究尚未取得突破性的进展。酵母细胞与哺乳动物细胞的基本生理机制是高度保守的,在酵母细胞中表达的人源性蛋白可以很好地保持原有功能,而且酵母细胞能为靶蛋白提供一个空白的表达背景避开哺乳动物各种复杂的生理过程对靶蛋白研究的干扰。本研究利用酿酒酵母细胞内不存在O-Glc NAc糖基化修饰系统的特性,通过导入OGT和OGA基因等方法构建酿酒酵母细胞O-Glc NAc修饰体系,致力于OGT酶调控机制的研究,为加深理解相关疾病的发病机理,确立治疗方法提供线索。OGT由2个结构域组成,N-末端的TPR结构域和C-末端的催化活性结构域,TPR结构域主要介导OGT与底物蛋白质间相互作用。OGT具有三种异构体,分别是胞质和胞核OGT(nc OGT)、线粒体OGT(m OGT)、短OGT(s OGT),它们的不同仅存在于N端,具有不同数目的 TPR重复单元,其中nc OGT具有13.5个TPR单元,而s OGT只有2.5个TPR单元。首先,本研究在酿酒酵母细胞内表达s OGT,发现s OGT抑制了酵母细胞的生长,并O-Glc NAc糖基化修饰了酵母细胞的多种蛋白质;而s OGT的活性突变子s OGTH127A的表达对酵母细胞的生长无影响。OGA和s OGT的共表达明显降低细胞的糖基化水平,并恢复了酵母细胞的生长。以上实验证明s OGT的O-Glc NAc糖基化活性抑制酿酒酵母细胞的生长。其次,本研究发现nc OGT,nc OGT活性突变子nc OGTH498A及TPR结构域的表达均会抑制酵母细胞的生长;但是,OGA,甚至OGAD174A(OGA活性突变体)与nc OGT的共表达都能恢复酵母细胞的生长。通过免疫共沉淀的实验,确认了nc OGT通过TPR结构域与OGA相互结合,证明nc OGT主要是通过其TPR结构域与细胞内蛋白质相互作用来抑制酵母的生长。本研究在酿酒酵母细胞内成功地构建了2个OGT的研究体系:(1)利用s OGT抑制酿酒酵母细胞生长的现象,从人源c DNA文库或化合物库中筛选与OGT活性相关的基因或药物,用于OGT活性调控机制的研究;(2)利用nc OGT抑制酿酒酵母细胞生长的现象,从人源c DNA文库中筛选和OGT的TPR结构域相互作用的蛋白质,用于nc OGT的底物识别机制的研究。有效地利用这2个体系,可以从相关化合物库中筛选出抑制人体细胞O-Glc NAc糖基化修饰的药物前体,为相关疾病的治疗开辟途径。