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目的:牙酸蚀症(dental erosion)越来越成为影响人类口腔健康的一大疾病,其可造成牙釉质的广泛丧失,进而侵蚀牙本质。由于软化的牙本质耐磨性显著降低,易在机械力的作用下发生病理性丧失。因此,如何延缓甚至阻止牙本质酸蚀性磨损已经成为一个重要议题。槲皮素是一种天然黄酮类化合物,兼具牙本质源性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)抑制及胶原交联作用,有望成为减少牙本质酸蚀性磨损的药物。根据现有文献及课题组前期研究,我们推论槲皮素可黏附于牙本质表面并渗入牙本质表层下,通过抑制牙本质源性MMPs的活性,以及通过交联作用增强牙本质胶原纤维的机械性能,从而提高牙本质的抗酸蚀性磨损性能。因此本研究的目的是1利用原位实验模型评估槲皮素对牙本质酸蚀性磨损的影响。2评估槲皮素的稳定性,探索槲皮素对牙本质黏附性能的影响因素,包括溶剂的pH、作用时间以及浓度,并评估槲皮素对牙本质的渗透深度。3评估槲皮素对外源性及牙本质源性性MMPs的抑制活性,以及其对牙本质胶原机械性能的影响。方法:1根据不同的处理溶液将牙本质试件随机分为6组(n=10),其中阴性对照组为去离子水和无水乙醇,阳性对照组为120μg/ml氯己定(chlorhexidine,CHX),实验组为75μg/ml、150μg/ml及300μg/ml的槲皮素溶液(以下简称Q75、Q150、Q300)。招募15名志愿者,制作颌垫式牙托(每个牙托包含4个牙本质试件),采用口内原位循环酸蚀再矿化+口外刷磨的方案进行试件处理。每天进行4次循环酸蚀(erosion cycle),每次5 min,在每天的第一次及最后一次酸蚀后30 min进行刷磨实验,刷磨次数为30次,连续7天。采用表面轮廓仪检测,验证槲皮素对牙本质酸蚀性磨损的影响。2以未调节pH的槲皮素为参照(槲皮素-乙醇原液),通过配置pH分别为3、5、7.4、8、10的槲皮素-乙醇溶液,借助紫外-可见光分光光度计(UV-visible spectrophotometer,UV-Vis)检测图谱变化,筛选出槲皮素稳定性较佳的pH值;根据以上结果,制备牙本质粉末,经槲皮素处理后,通过UV-Vis检测各组上清液吸光度,评估pH、浓度(75、150、300μg/ml)以及作用时间(1、2、4 min)对槲皮素黏附性能的影响;以槲皮素特征峰为参照,借助激光共聚焦拉曼光谱仪(laser confocal Raman spectrophotometer,LCRS)绘制经槲皮素处理后牙本质的2D拉曼光谱图像,检测槲皮素在牙本质表面的分布情况。任意选取2D拉曼图像中的一点,沿Z轴(深度)方向进行拉曼光谱扫描,绘制3D拉曼图像,评估槲皮素对牙本质的渗透深度。3以1,10-菲啰啉、CHX为阳性对照组,去离子水、无水乙醇为阴性对照组,Q75、Q150、Q300为实验组,向黑色96孔板中依次加入处理液(每组5个孔),MMP-8(1μg/ml)以及荧光底物,孵育后,分别在0 h、24 h采用酶标仪测取荧光信号强度,评估槲皮素对MMP-8的抑制活性。从Pub Chem数据库下载获得槲皮素的分子结构,从RCSB PDB数据库下载获得MMP-8的晶体结构,采用Auto Dock 4.2进行分子对接,探究槲皮素与MMP-8相互作用的方式及结合模式;制备7 mm×1.7 mm×0.7 mm的牙本质试件,根据不同的处理液随机分为6组(n=3),其中阳性对照组为CHX,阴性对照组为去离子水、无水乙醇,实验组为Q75、Q150、Q300。各组试件经处理液处理10 min后,均用柠檬酸酸蚀2 min,再将100μl荧光染料液滴于牙本质试件表面,孵育24 h后,用激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)获取30μm厚的光学切片,定量检测槲皮素对牙本质源性MMPs的抑制活性;制备0.5 mm×0.5mm×10 mm的牙本质试件,根据不同的处理液随机分为5组(n=12),阴性对照组为去离子水及无水乙醇,实验组为Q75、Q150、Q300。各组试件经处理液处理60 min后,采用微拉伸测试仪以1 mm/min的加载速度进行拉伸试验,记录试件断裂时的最大载荷,千分尺测量断裂面的实际面积,计算微拉伸强度。结果:1原位实验结果表明,与阴性对照组相比,所有实验组的表面丧失均显著降低(P均<0.001),其中Q150、Q300的表面丧失显著低于CHX(P均<0.05)。2在槲皮素稳定性的评估实验中,与槲皮素-乙醇原液相比,pH=7.4、5、3的槲皮素-乙醇溶液波形无明显变化,pH=10、8的槲皮素-乙醇溶液波形明显改变。pH=7.4、5的槲皮素-乙醇溶液在72 h内,最大吸收峰稍变弱,pH=3的槲皮素-乙醇溶液最大吸收峰在配置48 h后下降明显。在槲皮素黏附性能影响因素的探究实验中,pH以及作用时间对槲皮素的黏附性能影响甚微(P均>0.05)。随着浓度的提高,75、150、300μg/ml的槲皮素乙醇-原液对牙本质的黏附量增加,其中300μg/ml的槲皮素-乙醇原液黏附量显著多于其余两组(P均<0.05)。LCRS表明槲皮素均匀黏附在牙本质表面,其渗透深度可达30μm。3荧光定量实验表明槲皮素对MMP-8的抑制活性随着浓度的增加而增强,其中Q300的抑制活性与阳性对照组无显著差异(P均>0.05)。分子对接实验表明,槲皮素可通过与MMP-8的Ala-161、Glu-198和Tyr-216残基形成氢键结合,结合能为-38.456 KJ/mol;原位酶谱实验表明,Q75、Q150、Q300对牙本质源性MMPs的抑制活性随着浓度的增加而增强,其中Q300的抑制活性与CHX无显著差异(P=0.58);微拉伸实验表明,槲皮素各浓度组的微拉伸强度值均显著大于阴性对照组(P均<0.001)。结论:1基于原位实验,槲皮素处理的牙本质经酸蚀磨损循环后表面丧失显著降低,其中Q150、Q300效果更佳。2槲皮素在中性(pH=7.4)及弱酸性(pH=5)条件下具有较好的稳定性,而在碱性条件下,稳定性较差;槲皮素黏附性能影响因素实验表明,pH及作用时间均对槲皮素的黏附性能影响甚微。槲皮素浓度可影响其黏附性能,随着浓度升高,黏附性能增强;Q300对牙本质的渗透深度可达30μm。3槲皮素可显著抑制外源性及牙本质源性MMPs的活性,且具有浓度依赖性。此外,槲皮素还可通过提高牙本质胶原的机械性能间接起到稳定DOM的作用。