论文部分内容阅读
目的对ST1193型大肠埃希菌(E.coli ST1193)进行系统进化分析,探究不同地域来源菌株的进化轨迹,有助于更好的理解该序列类型(sequence type,ST型)的传播趋势。通过不同ST型菌株之间致病能力及生存能力的比较分析,评估E.coli ST1193是否具有种群优势性,探究E.coli ST1193成为优势克隆的可能性,揭示其在临床环境中传播的原因。方法1.菌株来源:51株E.coli ST1193及15株E.coli ST131来自于福建医科大学附属协和医院。纳入系统进化分析的25个E.coli ST1193全基因组序列来自于美国国家生物技术信息中心。2.系统进化分析:51株E.coli ST1193进行二代测序(Illumina测序),结合公开数据库来源全基因组序列提取核心基因组和附属基因组构建系统发育树。通过比较基因组学筛选进化分支间的特异性基因,对特异性基因进行GO分析。3.使用CGE server数据库和CARD数据库对E.coli ST1193的毒力基因、质粒复制子和耐药基因进行预测。4.E.coli ST1193致病能力分析:使用T24细胞进行黏附试验和侵袭试验,比较不同ST型菌株间黏附和侵袭能力差异。使用结晶紫染色法测定不同ST型菌株间的生物膜形成能力差异。使用含刚果红/考马斯亮蓝平板,通过观察形成的菌落形态差异,进一步分析不同ST型菌株间生物膜形成能力差异。5.E.coli ST1193生存能力分析:使用血清抗性试验,比较不同ST型菌株间抵抗血清杀菌能力的差异。使用过氧化氢抗性试验,比较不同ST型菌株间抵抗过氧化氢杀菌能力的差异。使用RAW264.7细胞进行抗吞噬试验,比较不同ST型菌株间抵抗吞噬能力的差异。6.统计学分析:运用SAS 9.4统计学软件进行数据分析,采用Graphpad Prism 7.0软件进行数据的作图。多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用Student’s t检验分析,实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示。双侧检验p<0.05视为差异有统计学意义。结果1.系统进化分析:核心基因组系统发育树结果显示76株E.coli ST1193可被分为两个系统进化分支:分支A和B。分支A包括25株非中国来源的菌株,分支B包括51株中国来源的菌株。分支A和B之间,共发现150个分支特异性基因存在基因缺失(Indels)。超过70%的分支特异性基因富集到“生物学过程”和“分子功能”模块。附属基因组系统发育树结果显示76株E.coli ST1193分被为7个系统进化分支:分支1到7。分支3和6与核心基因组系统发育树分支A高度相关。2.毒力基因、耐药基因及质粒复制子预测:研究共预测到24种毒力基因。检出率超过70.0%的毒力基因有chu A、fyu A、yfc V、vat、sat、iha、gad和sen B。毒力基因cia、neu C、gad和tra T在分支A和B间的分布存在统计学差异(p<0.05)。本研究共预测到19种质粒复制子类型。98.7%的E.coli ST1193至少携带一种质粒复制子类型。96.1%的E.coli ST1193含有两种类型的FI型复制子(Inc FIA和Inc FIB)。Colp VC、Inc Q1、Col156和Inc B/O/K/Z在分支A和分支B间的分布存在统计学差异(p<0.05)。本研究共预测到71种耐药基因。检出率超过50.0%的获得性耐药基因包括bla TEM-1、sul2、APH(6)-ID、dfr A17和mph A。bla CTX-M-55、bla TEM-1、sul2、tet(B)、tet(R)、APH(6)-ID和AAC(3)-iid在分支A和分支B间的分布存在统计学差异(p<0.05)。3.bla CTX-M-55上、下游基因环境具有多样性:bla CTX-M-55均位于同源基因簇ORF477的下游。在bla CTX-M-55的基因下游和上游分别检出不同的基因移动元件,如ISEc9、Tn3和整合酶基因等。两株中国来源的菌株中,在bla CTX-M-55的基因上游检测到其他类型β-内酰胺酶基因(bla TEM-1)。4.E.coli ST1193致病能力分析:与阴性对照相比,E.coli ST1193具有较强的细胞黏附、侵袭及生物膜形成能力(p<0.05)。与E.coli ST131相比,ST1193表现出相似的细胞黏附、侵袭及生物膜形成能力(p>0.05)。大菌落形成试验结果显示:66.7%的E.coli ST1193既不形成卷曲菌毛也无法产生胞外纤维素。与E.coli ST131相比,ST1193菌株形成卷曲菌毛的特征具有统计学差异(p<0.05)。5.E.coli ST1193生存能力分析:与阴性对照相比,E.coli ST1193具有较强的抵抗血清杀菌能力、抵抗过氧化氢灭菌能力和抵抗吞噬细胞吞噬能力(p<0.05)。与E.coli ST131相比,ST1193表现出相似的抵抗血清杀菌能力、抵抗过氧化氢灭菌作用及抵抗吞噬细胞吞噬能力,差异无统计学意义(p>0.05)。结论1.中国来源与非中国来源的E.coli ST1193在系统进化上具有显著区别,提示E.coli ST1193在中国和非中国地区传播的不同系统进化特征。这种不同的系统进化特征既说明这种ST型的全球传播,也提示该ST型在特定地理位置引入后的本地化克隆播散的可能性。2.中国来源与非中国来源的E.coli ST1193在毒力基因、质粒复制子类型和耐药基因的分布上也存在统计学差异(p<0.05)。3.与ST131相比,E.coli ST1193存在成为优势克隆的可能性。