狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus, RABV）引起的一种古老的人兽共患病，以脑脊髓炎、狂躁不安及进行性麻痹为主要特征，该病病死率为100%。近年来我国平均每年因狂犬病而死亡的人数约有2,000人，其中大多数是由犬、猫或野生动物咬伤所致。动物狂犬病的及时正确诊断对于疑似患者的暴露后治疗及指导动物狂犬病预防和控制具有重要意义。目前，用于动物狂犬病诊断方法有多种，主要包括病毒直接观察、病毒分离培养、病毒蛋白检测及病毒基因检测。病毒直接观察能够直接观察到病毒真实形态，但是需要在配备电镜的专业实验室进行观察；病毒的分离培养可获得病毒，但是需要考虑生物安全及病毒对细胞和动物的适应性差异；病毒蛋白检测是WHO和OIE共同推荐的最广泛应用的金标准诊断方法，但是需要标准化荧光标记抗体、荧光显微镜与经过培训的操作人员，整个过程繁琐且检测敏感性低。传统的狂犬病病毒基因检测诊断方法包括普通RT-PCR和巢氏RT-PCR，但或敏感性差或耗时较长且需接触致癌染料。荧光定量RT-PCR作为新兴的狂犬病病毒基因诊断方法由于其敏感、快速、结果直观的特性受到广泛应用。国内外已报道多种狂犬病病毒荧光定量RT-PCR方法，但在实际应用定性诊断过程中：探针法荧光定量RT-PCR背景信号强度高、扩增曲线不典型、结果判定较困难等问题时有发生；普通染料法荧光定量RT-PCR存在特异性差、假阳性较多的缺点。因此，建立敏感特异的基于狂犬病病毒Leader序列荧光定量RT-PCR方法是解决我国动物狂犬病诊断的重要途径，也对公共卫生具有一定意义。狂犬病病毒Leader序列荧光定量RT-PCR方法不仅可应用于动物狂犬病定性诊断，也可应用于不同狂犬病病毒株精确定量。特别是在狂犬病病毒基础研究中，传统方法很难同时对街毒、固定毒和弱毒进行定量，原因是：街毒对细胞适应性差，无法通过TCID50对其进行滴定；弱毒一般不会引起成年实验动物死亡，亦无法通过LD50对其进行滴定。不同毒力狂犬病病毒精确定量的实现，则为狂犬病病毒致病机理及炎症反应研究奠定基础。在病毒滴度确定基础上，探索不同毒力狂犬病病毒通过外周途径感染但尚未进入中枢神经系统之前，血清中炎症细胞因子的变化，对揭示狂犬病病毒感染研究具有重要意义，同时也为分子标志物诊断研究提供参考。鉴于我国狂犬病诊断及研究的需要，本研究进行以下实验：1.基于狂犬病病毒基因组Leader序列荧光定量RT-PCR方法的建立。试验内容：①对GenBank收录的约200株狂犬病病毒全基因组进行序列比对分析。②分别设计针对RABV基因组起始端Leader序列的反转录单引物与针对RABV核蛋白基因保守区域的扩增引物。③构建包含有RABV街毒株BD06全长核蛋白基因的标准质粒并进行系列梯度稀释，以此建立荧光定量标准曲线。④利用数种不同宿主来源的细胞、非RABV病毒与阴性脑组织，进行荧光定量RT-PCR特异性试验与敏感性试验。2.基于狂犬病病毒Leader序列荧光定量RT-PCR检测试剂盒的组装与在临床样品检测中的应用。试验内容：①检测试剂盒的操作过程优化，即将部分试剂预混并将整个检测过程操作时间缩短至两小时。②检测试剂盒初步组装，将检测试剂盒各种组分按每盒40头份进行配制并撰写使用说明书。③对来自我国江西地区210份鼬獾临床样品进行检测。3.狂犬病病毒街毒、弱毒分别感染的小鼠血清炎症细胞因子的比较研究。试验内容：①利用狂犬病病毒Leader序列荧光定量RT-PCR，对狂犬病病毒街毒株BD06与弱毒株SRV9感染的3日龄乳鼠发病后脑组织内病毒基因组拷贝数进行定量。②分别使用含有相同基因组拷贝数的狂犬病病毒街毒株与弱毒株乳鼠脑组织毒，通过外周肌肉注射途径感染BALB/c小鼠。③利用瑞博奥炎症因子芯片对感染后第一天与第二天血清炎症细胞因子进行检测。通过以上试验，获得以下结果：1.通过狂犬病病毒全基因组序列比对并参考文献，设计一条针对狂犬病病毒全基因组Leader序列（而非mRNA或反基因组RNA）的反转录引物与一对针对核蛋白基因的扩增引物。通过三条引物的使用以及标准阳性质粒的应用，建立符合有效性的荧光定量RT-PCR。该方法具有良好的特异性与敏感性。2.实现了狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测过程的优化，检测过程用时低于以往基因检测技术，并完成了检测试剂盒的初步组装与使用说明书的撰写。对210份临床样品进行检测，检出4份阳性样品。所检出阳性样品与免疫荧光检测（FAT）结果相符。3.发现同一基因组拷贝数的狂犬病病毒街毒株或弱毒株引起宿主的不同炎症应答。在感染1天后，街毒株感染小鼠血清中4种炎症因子水平均高于弱毒株且呈显著性差异，即街毒可引起更为严重的炎症反应。综合以上结果，得出以下结论：1.建立一种具有良好特异性与敏感性的基于狂犬病病毒Leader序列荧光定量RT-PCR方法，即满足定性诊断需要也可应用于定量分析，具有良好的临床诊断应用前景。2.初步组装出狂犬病病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，经210份鼬獾样品检测试验证明，检测结果与国际金标准FAT一致，诊断效果确实可靠。3.等量基因组拷贝数的不同病毒外周感染发现，街毒引起更剧烈的炎症反应，且IL-1α、IL-2、IL-5与IFN-γ变化显著。该研究为狂犬病分子标志物诊断提供参考。论文创新点：1．首次使用在整个狂犬病毒属内均高度保守的部分简并的Leader序列反转录单引物以获得单股负链病毒基因组cDNA，以此增强了下游试验的特异性与敏感性。本研究实践为整个负股单链RNA病毒的荧光定量RT-PCR研究提供新思路。2．国内首次建立基于狂犬病病毒基因组cDNA核蛋白基因序列的荧光定量RT-PCR方法。该方法既可用于定性诊断检测又可用于精确定量分析。3．在BALB/c小鼠动物模型上，首次比较相同基因组拷贝数的街毒株与弱毒株外周感染后尚未进入中枢神经系统之前所引起机体血清中的不同炎症应答，证实街毒能够引起较严重的炎症反应。