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目的:制备HIV-1 TatE-pET32a融合蛋白,研究Tat融合蛋白(Tat Fusion Protein, Tat-FP)与弗氏佐剂乳化对SD大鼠的免疫原性和毒性反应,明确Tat-FP的毒性反应的严重程度和可逆性,对Tat-FP作为HIV-1疫苗的安全性做出初步评价。方法:(1)Tat-FP制备:使用已构建好的含pET32a-TatE (1-101aa)质粒的大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)菌株,大量培养,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalacto- side,IPTG)诱导目的蛋白的表达;离心收集菌体,用lysis buffer缓冲液重悬后超声裂解菌体,低温高速离心,收集上清,目的蛋白即存在于上清中;滤纸过滤后,用Ni-NTA纯化柱(镍柱)对滤液进行纯化,收集目的蛋白,即Tat-FP;经SDS-PAGE电泳验证和复性后,以Bradford法检测蛋白浓度,间接ELISA法检测Tat-FP的免疫原性。(2)Tat-FP的初步长期毒性研究:Sprague-Dawley(SD)大鼠70只,随机分为7个组:Tat-FP iv组(200μg/只)、Tat-FP sc组(200μg/只)、Tat-FP(20μg/只)+弗氏佐剂皮下注射低剂量组、Tat-FP(200μg/只)+弗氏佐剂皮下注射高剂量组、弗氏佐剂对照组、溶媒+弗氏佐剂对照组、生理盐水对照组。每周给药一次,共给药8次,除第一组为静脉注射给药外,其余六个组均为皮下注射给药,用到佐剂时均需与蛋白等体积乳化后给药,各组给药体积均为0.4ml /只。每周称体重一次,给药结束一周后(W9)每组麻醉处死6只动物,恢复3周后(W12)每组麻醉处死剩余4只动物。动物麻醉后均腹主动脉采血进行血液生化、血液学、免疫原性和免疫毒性等指标测定,同时对重要脏器进行病理组织学观察。第3、5、7、9、12周采血检测抗体。测定的血液学指标有红细胞(RBC)计数、血红蛋白(HGB)定量、红细胞压积(Hct)、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白容量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数(PLAT)、白细胞(WBC)计数、中性粒细胞(NEUT)、淋巴细胞(LYMPH)、单核细胞(MONO)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BASO)、大未染色细胞(LUC)、网织红细胞计数(RETIC)、凝血酶原时间(PT);血液生化指标有血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆红素(TBIL)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(Glu)、总胆固醇(TCH)、甘油三脂(TG)、肌酸磷酸激酶(CPK),血清钙(Ca)、磷(P)、钾(K)、钠(Na)、氯(Cl)。(3)流式细胞术检测Tat-FP对外周血CD4~+、CD8~+ T淋巴细胞分型的影响。(4)间接ELISA法检测血清抗体水平;ELISA法检测血清IgG、IgM、IgA和C3的水平。(5)考察Tat-FP对IL-4, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-10和TNF-α等细胞因子水平的影响。结果:(1)除Tat-FP iv组和生理盐水对照组以外,其余组的动物给药后各组均有部分动物出现不同程度的抓挠给药部位;各个皮下注射组(生理盐水对照组除外)动物的给药部位均出现不同程度肿胀、皮肤溃烂和结痂,解剖发现肿块里面充满了脓性物质,可能是由于佐剂与药物乳化后,延缓了药物的吸收,导致局部炎性反应。(2)与溶媒+弗氏佐剂对照组和/或生理盐水对照组相比,Tat-FP+弗氏佐剂高剂量可使停药期大鼠NEUT比例明显升高,LYMPH比例明显降低,WBC虽没统计差异但也有升高趋势。可能与此剂量引起的局部炎症较严重有关。Tat-FP+弗氏佐剂高剂量组可使恢复期大鼠NEUT比例明显升高,LYMPH比例明显降低。可能与此剂量引起的局部炎症尚没有完全恢复有关。(3)无论是停药期还是恢复期,与佐剂对照组和/或溶媒+弗氏佐剂对照组和/或生理盐水对照组相比,Tat-FP各给药组的部分血液生化指标虽然有显著差异,但指标数值均在正常范围内波动,而且无明显量效关系,与药物作用无关。(4)骨髓涂片检查提示骨髓组织出现了炎性相关的反应。(5)病理组织学检查各组主要脏器绝对重量和相对重量的改变无明显量效关系,各组动物均未观察到与药物作用相关的实质脏器(如肝脏等)病理改变,未发现任何免疫毒性相关的组织学病变,但含佐剂成分给药后,大鼠均出现了局部炎症。(6)与生理盐水对照组相比,恢复期时,Tat-FP sc组和Tat-FP+弗氏佐剂高剂量组均出现了CD4~+/CD8~+比值的显著性升高,同时IFN-γ的水平显著升高,而CTL细胞(CD8~+CD28~+)活性水平与IFN-γ呈正相关,抑制性T细胞(CD8~+CD28~-)的活性水平与IFN-γ呈负相关,所以提示这种变化可能与Tat蛋白对CD8~+T细胞种类中抑制性T细胞水平的降低有关。(7)抗体检测结果提示Tat-FP+弗氏佐剂可产生高滴度、持续的抗体,且Tat-FP高剂量组抗体产生早,持续时间长,抗体滴度高(1:12800);Tat-FP+弗氏佐剂高剂量组IgG和C3显著高于对照组,这些结果综合表明Tat-FP能够激发有效的体液免疫反应。(8)细胞因子检测结果显示,与对照组相比,Tat-FP+弗氏佐剂高剂量组出现了IFN-γ和IL-4的显著升高,提示高剂量Tat-FP+弗氏佐剂给药增强了动物的Th1型和Th2型免疫反应。结论:Tat-FP与佐剂乳化后每周1次,连续8周sc大鼠,可使动物产生高滴度抗体,对免疫功能有一定增强作用,同时会引起局部炎症反应,但作用可逆。给药时应注意蛋白本身的用量及其与佐剂的配比,避免过高剂量与佐剂合用时可能会引起较严重的局部炎症反应。Tat-FP作为HIV候选疫苗其疗效和安全性还有待进一步深入研究。