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前言FA/BRCA通路是正常细胞参与DNA修复、细胞周期与凋亡调控、解毒功能调节、生命信号转导等必需的。如果该通路受损会导致细胞染色体不稳定以及对DNA损伤剂高度敏感。FA复合体的稳定和FANCD2的泛素化激活是FA/BRCA通路的关键步骤,而FANCF在此过程中发挥着重要作用。FANCF蛋白低表达或功能缺失会干扰FA/BRCA通路的正常功能,进而参与肿瘤发生及耐药性的形成。目前,已在多种实体肿瘤中证实:FANCF蛋白低表达或功能缺失,与肿瘤的发生、发展及耐药性的形成相关。而关于FANCF是否参与乳腺癌发生发展及耐药性的产生与调控尚未见报道。本实验研究FANCF基因沉默对乳腺癌MCF7细胞生物学特性的影响,并检测相关指标的变化,探讨FANCF基因是否参与乳腺癌的发生、发展及耐药性的形成。实验方法本实验分为三部分:1、FANCF-shRNA表达质粒的构建:根据相关文献报道,使用Ambion公司的在线设计软件,设计并合成能够编码针对FANCF基因的小发夹RNA（FANCF-shRNA）的DNA模板,将其插入到p SliencerTM4.1-CMV neo表达质粒中,形成p SliencerTM4.1-CMV-FANCF-shRNA重组质粒;将该重组质粒转化到Ecoli感受态细胞JM109中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增;通过PCR及基因测序方法筛选出插入正确的FANCF-shRNA表达质粒;2、MCF-7-FANCF-RNAi细胞模型的建立:碱裂解法提取质粒,脂质体法转染人乳腺癌MCF-7细胞,RT-PCR法检测FANCF基因mRNA表达水平,确认FANCF基因沉默;3、相关指标检测:分别采用MTT法、流式细胞仪PI单染法及FITC/PI双染法检测FANCF基因沉默前后细胞增殖、周期及凋亡等生物学特性的变化;RT-PCR法检测FANCF基因沉默前后耐药相关基因BCRP、P-gp、MRP、LRP mRNA表达水平的变化。离体水平探讨FANCF与乳腺癌生物学特性及耐药性形成的相关性。实验结果1、成功构建FANCF-shRNA表达质粒:含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR扩增片段约为250 bp,并且其基因测序结果显示插入片段碱基排列顺序正确,没有突变,说明FANCF-shRNA表达质粒构建成功;2、成功建立MCF-7-FANCF-RNAi细胞模型:与阴性对照组相比,转染FANCF-shRNA质粒后第2天、第3天、第5天和第7天,FANCF基因mRNA表达水平均明显减低,表达抑制率分别为36.51%±6.84%、37.03%±6.61%、53.03%±9.33%和39.51%±10.13%（P＜0.05）,说明FANCF基因沉默,MCF-7-FANCF-RNAi细胞模型成功建立;3、FANCF基因沉默对人乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响:与阴性对照组相比,FANCF基因沉默可抑制MCF-7细胞增殖（转染后48h和72h的抑制率分别为12.65%±1.24%和29.64%±0.87%,P＜0.05）,促进细胞凋亡（转染后48 h和72 h的凋亡率分别为28.95%±1.81%和49.00%±2.32%,P＜0.05）,并使细胞周期阻滞于S期（转染后48 h,S期细胞比率为33.38%±0.68%,P＜0.05）:4、FANCF基因沉默对人乳腺癌MCF-7细胞耐药性的影响:与阴性对照组相比,FANCF基因沉默后,BCRP mRNA表达水平明显降低,转染后第3天、第5天和第7天的表达抑制率分别为35.14%±8.71%、38.39%±8.38%和27.23%±6.98%（P＜0.05）;P-gp mRNA表达水平略有降低,转染后第7天表达抑制率为29.98%±3.42%（P＜0.05）;MRP和LRP mRNA表达无明显变化。结论1、FANCF基因沉默可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,促进细胞凋亡,并使细胞周期阻滞于S期;2、FANCF基因沉默可抑制BCRP等耐药相关基因的mRNA表达,参与乳腺癌细胞耐药性的调控。