论文部分内容阅读
第一部分：HSV-2感染VK2/E6E7细胞不同时间点自噬关键蛋白LC3B-II的表达变化
【目的】研究HSV-2感染VK2/E6E7细胞不同时间点自噬关键蛋白表达的情况，探索HSV-2感染的VK2/E6E7细胞模型中自噬随病毒感染时间的变化规律，为探讨细胞自噬与HSV-2感染的关系奠定基础。
【方法】利用Vero细胞为宿主扩增HSV-2，并用半数致组织或细胞病变(TCID50)法测定收获的HSV-2的毒力，再用扩增后的HSV-2感染VK2/E6E7细胞。模型成功的标准为HSV-2感染VK2/E6E7细胞24h后MTT法测定细胞存活率为40%-60%之间。选择能达到造模标准的病毒感染VK2/E6E7细胞，分别在感染后的0、6、12、18、24、48h收获细胞，WesternBlot法检测自噬关键蛋白LC3B-II的表达水平。
【结果】Vero细胞扩增72h后收获的HSV-2病毒用Reed-Muench方法测定TCID50为10-6-10-7之间，用此毒力的HSV-2感染VK2/E6E7细胞24h后可使其细胞存活率为40%-60%之间，即造模成功。HSV-2感染VK2/E6E7细胞不同时间(0、6、12、18、24、48h)后收获细胞，Westernblot结果显示与正常组相比，HSV-2感染的模型组中内源性LC3B-II的表达在每个对应的时间点均有显著增加，其中在感染后24h增加最多。
【结论】根据课题组前期的研究及本实验的验证，以Vero细胞为宿主扩增HSV-2病毒的方法可以成功造模。另外，与对照组相比，HSV-2感染VK2/E6E7细胞后24hLC3B-II增加最多，因此选择感染后24h作为后续实验的观察时间点。
第二部分：HSV-2感染VK2/E6E7细胞中自噬通量的变化
【目的】研究HSV-2感染VK2/E6E7细胞模型中自噬通量的变化，探索HSV-2感染对自噬通量的影响，为后续自噬与抗HSV-2病毒感染的关系研究奠定基础。【方法】造模方法同前，感染时间为24h。应用自噬溶酶体抑制剂BafilomycinA1(Baf A1)后，利用免疫荧光及Westernblot观察自噬小体的数量、检测自噬蛋白LC3B-II、SQSTM1/p62、Atg5的表达，评估自噬通量。
【结果】免疫荧光和Westernblot数据显示，与正常对照组相比，HSV-2感染的VK2/E6E7细胞中，自噬小体的数量及自噬蛋白LC3B-II的表达增加，SQSTM1/p62、Atg5的表达减少。与单独使用自噬溶酶体抑制剂BafA1处理相比，BafA1处理感染HSV-2的细胞后LC3B光点数，LC3B-II和SQSTM1/p62蛋白表达水平均降低。
【结论】HSV-2感染VK2/E6E7细胞后Atg5表达减少，但LC3B-II的表达增加，SQSTM1/p62的表达减少，不能确定HSV-2对自噬真正的影响。因此应用BafA1探索自噬通量，结果说明HSV-2感染确实阻断了VK2/E6E7细胞中的自噬通量。
第三部分：中药复方洁泽1号通过调控自噬抗VK2/E6E7细胞中HSV-2感染的实验研究
【目的】上述实验表明HSV-2感染的VK2/E6E7细胞中自噬通量受到了抑制。通过对洁泽1号作用于HSV-2感染VK2/E6E7细胞中自噬通量变化的研究，探索洁泽1号抗HSV-2感染与其对自噬通量的调控的关系。
【方法】
①采用MTT法检测JZ-1对VK2/E6E7细胞的细胞毒性和抗HSV-2活性，将不同浓度(0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/mL)的JZ-1加入VK2/E6E7细胞24h，探索最佳的抗HSV-2的JZ-1药物浓度。
②mRFP-GFP-LC3B慢病毒转染VK2/E6E7细胞后用共聚焦显微镜观察自噬结构。由于GFP信号对pH敏感，因此该方法可用于可视化自噬小体和自噬溶酶体的数量。黄色斑点代表重叠的红色和绿色斑点，表明自噬体尚未与溶酶体融合，而红色斑点对应于自噬溶酶体。同时用透射电镜(TEM)观察不同处理后细胞中自噬结构的变化。
③采用第二部分中所述通过BafA1检测自噬通量，并通过免疫荧光和Westernblot检测自噬关键蛋白及HSV-2病毒蛋白gD、ICP5的表达，评估不同情况下自噬通量和JZ-1的抗病毒效果。
④在运用Rapamycin(Rapa)和3-MA分别诱导和抑制自噬后，检测HSV-2组、JZ-1+HSV-2组细胞中自噬结构/蛋白和病毒蛋白的表达。
【结果】
①当JZ-1浓度大于5mg/mL时，表现出明显的细胞毒性作用。不同浓度的JZ-1(1.25、2.5、5、10、20 mg/mL)可抑制HSV-2的病毒蛋白ICP5和gD，同时提高细胞活力。Westernblot结果表明，HSV-2感染的细胞中ICP5和gD的表达增加，然而在JZ-1+HSV-2细胞中ICP5和gD的表达水平则显著降低。
②mRFP-GFP-LC3B转染结果显示，在感染HSV-2后24小时的细胞中观察到黄色点的数量和比例显著增加，即自噬小体未与溶酶体融合，而JZ-1+HSV-2细胞中自溶酶体的数量显著增加。另外，TEM观察感染HSV-2后24小时的细胞中自噬相关结构减少，JZ-1+HSV-2处理组的细胞中自噬结构增多。
③免疫荧光和Westernblot结果显示，与Baf+HSV-2处理组相比，JZ-1+BafA1+HSV-2处理组的LC3B点数和LC3B-II和SQSTM1/p62蛋白表达水平均增加。这表明JZ-1诱导了自噬通量。与HSV-2感染组相比，JZ-1+HSV-2中Atg5的增加进一步证实了以上结论。
④mRFP-GFP-LC3B转染结果显示，在Rapa+HSV-2组中自噬溶酶体的数量增加，但在3-MA+HSV-2、3-MA+JZ-1+HSV-2组显著减少。同样地，免疫荧光和Westernblot显示，在Rapa+HSV-2组中，LC3B光点的数目以及LC3B-II和Atg5蛋白的表达水平均升高，而在3-MA+HSV-2组中则降低。测定病毒蛋白ICP5和gD以评估其抗HSV-2的作用，结果表明，与HSV-2组相比，Rapa+HSV-2组的ICP5和gD的表达降低，而在3-MA+HSV-2组中表达进一步增加。此外，JZ-1+3-MA+HSV-2处理组的ICP5和gD蛋白表达水平高于JZ-1+HSV-2组。
【结论】HSV-2感染细胞中ICP5和gD的表达增加，表明病毒复制增强。然而，在JZ-1+HSV-2组中ICP5和gD的表达水平显著降低，表明JZ-1具有抗HSV-2的作用。应用BafA1、Rapa和3-MA后自噬小体和自噬蛋白表达水平的变化表明JZ-1诱导了自噬通量。ICP5和gD的检测表明自噬的激活可以抗HSV-2感染，且JZ-1的抗HSV-2效应可以通过诱导细胞自噬通量来介导。
第四部分：基于PI3K/Akt/mTOR通路探讨中药复方洁泽1号诱导自噬的机制
【目的】PI3K/Akt/mTOR通路是哺乳动物自噬调控的主要通路之一。基于PI3K/Akt/mTOR通路探究JZ-1对HSV-2感染的VK2/E6E7细胞自噬调控作用的机制。
【方法】采用qRT-PCR及Westernblot的方法检测不同处理组PI3K/Akt/mTOR通路中关键分子PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR的表达情况。并且应用PI3K广谱抑制剂LY294002抑制该通路后检测上述指标及自噬相关指标，从正反两个方向探讨该通路与JZ-1增强自噬通量的关系。
【结果】qRT-PCR分析和Westernblot结果显示，与正常组相比，HSV-2感染的VK2/E6E7细胞中PI3K的表达水平、Akt和mTOR的磷酸化水平(p-Akt和p-mTOR)显著增加，在JZ-1+HSV-2组中则显著降低。应用LY294002抑制PI3K后，PI3K/Akt/mTOR通路中各关键蛋白的表达均受到抑制，自噬关键蛋白LC3B-II、Atg5的表达在LY294002处理组和LY294002+JZ-1处理组无差异。
【结论】JZ-1在增强自噬通量的同时确可抑制PI3K/Akt/mTOR通路的表达，且应用LY294002抑制该通路后JZ-1不能再增强自噬，从正反两个方向说明JZ-1确可通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路通路达到增强自噬的效果。
【目的】研究HSV-2感染VK2/E6E7细胞不同时间点自噬关键蛋白表达的情况，探索HSV-2感染的VK2/E6E7细胞模型中自噬随病毒感染时间的变化规律，为探讨细胞自噬与HSV-2感染的关系奠定基础。
【方法】利用Vero细胞为宿主扩增HSV-2，并用半数致组织或细胞病变(TCID50)法测定收获的HSV-2的毒力，再用扩增后的HSV-2感染VK2/E6E7细胞。模型成功的标准为HSV-2感染VK2/E6E7细胞24h后MTT法测定细胞存活率为40%-60%之间。选择能达到造模标准的病毒感染VK2/E6E7细胞，分别在感染后的0、6、12、18、24、48h收获细胞，WesternBlot法检测自噬关键蛋白LC3B-II的表达水平。
【结果】Vero细胞扩增72h后收获的HSV-2病毒用Reed-Muench方法测定TCID50为10-6-10-7之间，用此毒力的HSV-2感染VK2/E6E7细胞24h后可使其细胞存活率为40%-60%之间，即造模成功。HSV-2感染VK2/E6E7细胞不同时间(0、6、12、18、24、48h)后收获细胞，Westernblot结果显示与正常组相比，HSV-2感染的模型组中内源性LC3B-II的表达在每个对应的时间点均有显著增加，其中在感染后24h增加最多。
【结论】根据课题组前期的研究及本实验的验证，以Vero细胞为宿主扩增HSV-2病毒的方法可以成功造模。另外，与对照组相比，HSV-2感染VK2/E6E7细胞后24hLC3B-II增加最多，因此选择感染后24h作为后续实验的观察时间点。
第二部分：HSV-2感染VK2/E6E7细胞中自噬通量的变化
【目的】研究HSV-2感染VK2/E6E7细胞模型中自噬通量的变化，探索HSV-2感染对自噬通量的影响，为后续自噬与抗HSV-2病毒感染的关系研究奠定基础。【方法】造模方法同前，感染时间为24h。应用自噬溶酶体抑制剂BafilomycinA1(Baf A1)后，利用免疫荧光及Westernblot观察自噬小体的数量、检测自噬蛋白LC3B-II、SQSTM1/p62、Atg5的表达，评估自噬通量。
【结果】免疫荧光和Westernblot数据显示，与正常对照组相比，HSV-2感染的VK2/E6E7细胞中，自噬小体的数量及自噬蛋白LC3B-II的表达增加，SQSTM1/p62、Atg5的表达减少。与单独使用自噬溶酶体抑制剂BafA1处理相比，BafA1处理感染HSV-2的细胞后LC3B光点数，LC3B-II和SQSTM1/p62蛋白表达水平均降低。
【结论】HSV-2感染VK2/E6E7细胞后Atg5表达减少，但LC3B-II的表达增加，SQSTM1/p62的表达减少，不能确定HSV-2对自噬真正的影响。因此应用BafA1探索自噬通量，结果说明HSV-2感染确实阻断了VK2/E6E7细胞中的自噬通量。
第三部分：中药复方洁泽1号通过调控自噬抗VK2/E6E7细胞中HSV-2感染的实验研究
【目的】上述实验表明HSV-2感染的VK2/E6E7细胞中自噬通量受到了抑制。通过对洁泽1号作用于HSV-2感染VK2/E6E7细胞中自噬通量变化的研究，探索洁泽1号抗HSV-2感染与其对自噬通量的调控的关系。
【方法】
①采用MTT法检测JZ-1对VK2/E6E7细胞的细胞毒性和抗HSV-2活性，将不同浓度(0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/mL)的JZ-1加入VK2/E6E7细胞24h，探索最佳的抗HSV-2的JZ-1药物浓度。
②mRFP-GFP-LC3B慢病毒转染VK2/E6E7细胞后用共聚焦显微镜观察自噬结构。由于GFP信号对pH敏感，因此该方法可用于可视化自噬小体和自噬溶酶体的数量。黄色斑点代表重叠的红色和绿色斑点，表明自噬体尚未与溶酶体融合，而红色斑点对应于自噬溶酶体。同时用透射电镜(TEM)观察不同处理后细胞中自噬结构的变化。
③采用第二部分中所述通过BafA1检测自噬通量，并通过免疫荧光和Westernblot检测自噬关键蛋白及HSV-2病毒蛋白gD、ICP5的表达，评估不同情况下自噬通量和JZ-1的抗病毒效果。
④在运用Rapamycin(Rapa)和3-MA分别诱导和抑制自噬后，检测HSV-2组、JZ-1+HSV-2组细胞中自噬结构/蛋白和病毒蛋白的表达。
【结果】
①当JZ-1浓度大于5mg/mL时，表现出明显的细胞毒性作用。不同浓度的JZ-1(1.25、2.5、5、10、20 mg/mL)可抑制HSV-2的病毒蛋白ICP5和gD，同时提高细胞活力。Westernblot结果表明，HSV-2感染的细胞中ICP5和gD的表达增加，然而在JZ-1+HSV-2细胞中ICP5和gD的表达水平则显著降低。
②mRFP-GFP-LC3B转染结果显示，在感染HSV-2后24小时的细胞中观察到黄色点的数量和比例显著增加，即自噬小体未与溶酶体融合，而JZ-1+HSV-2细胞中自溶酶体的数量显著增加。另外，TEM观察感染HSV-2后24小时的细胞中自噬相关结构减少，JZ-1+HSV-2处理组的细胞中自噬结构增多。
③免疫荧光和Westernblot结果显示，与Baf+HSV-2处理组相比，JZ-1+BafA1+HSV-2处理组的LC3B点数和LC3B-II和SQSTM1/p62蛋白表达水平均增加。这表明JZ-1诱导了自噬通量。与HSV-2感染组相比，JZ-1+HSV-2中Atg5的增加进一步证实了以上结论。
④mRFP-GFP-LC3B转染结果显示，在Rapa+HSV-2组中自噬溶酶体的数量增加，但在3-MA+HSV-2、3-MA+JZ-1+HSV-2组显著减少。同样地，免疫荧光和Westernblot显示，在Rapa+HSV-2组中，LC3B光点的数目以及LC3B-II和Atg5蛋白的表达水平均升高，而在3-MA+HSV-2组中则降低。测定病毒蛋白ICP5和gD以评估其抗HSV-2的作用，结果表明，与HSV-2组相比，Rapa+HSV-2组的ICP5和gD的表达降低，而在3-MA+HSV-2组中表达进一步增加。此外，JZ-1+3-MA+HSV-2处理组的ICP5和gD蛋白表达水平高于JZ-1+HSV-2组。
【结论】HSV-2感染细胞中ICP5和gD的表达增加，表明病毒复制增强。然而，在JZ-1+HSV-2组中ICP5和gD的表达水平显著降低，表明JZ-1具有抗HSV-2的作用。应用BafA1、Rapa和3-MA后自噬小体和自噬蛋白表达水平的变化表明JZ-1诱导了自噬通量。ICP5和gD的检测表明自噬的激活可以抗HSV-2感染，且JZ-1的抗HSV-2效应可以通过诱导细胞自噬通量来介导。
第四部分：基于PI3K/Akt/mTOR通路探讨中药复方洁泽1号诱导自噬的机制
【目的】PI3K/Akt/mTOR通路是哺乳动物自噬调控的主要通路之一。基于PI3K/Akt/mTOR通路探究JZ-1对HSV-2感染的VK2/E6E7细胞自噬调控作用的机制。
【方法】采用qRT-PCR及Westernblot的方法检测不同处理组PI3K/Akt/mTOR通路中关键分子PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR的表达情况。并且应用PI3K广谱抑制剂LY294002抑制该通路后检测上述指标及自噬相关指标，从正反两个方向探讨该通路与JZ-1增强自噬通量的关系。
【结果】qRT-PCR分析和Westernblot结果显示，与正常组相比，HSV-2感染的VK2/E6E7细胞中PI3K的表达水平、Akt和mTOR的磷酸化水平(p-Akt和p-mTOR)显著增加，在JZ-1+HSV-2组中则显著降低。应用LY294002抑制PI3K后，PI3K/Akt/mTOR通路中各关键蛋白的表达均受到抑制，自噬关键蛋白LC3B-II、Atg5的表达在LY294002处理组和LY294002+JZ-1处理组无差异。
【结论】JZ-1在增强自噬通量的同时确可抑制PI3K/Akt/mTOR通路的表达，且应用LY294002抑制该通路后JZ-1不能再增强自噬，从正反两个方向说明JZ-1确可通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路通路达到增强自噬的效果。