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番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus, ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的成员之一,基因组为单链正义RNA,大小约为6.4 kb,编码了3个非结构蛋白和17.6 kDa的外壳蛋白(coat protein, CP)。通过汁液机械摩擦传播及种子带毒传播,番茄是其主要的寄主,对番茄的品质和产量造成了严重的影响。国内外研究者对ToMV生物学和分子生物学特性方面做了大量的研究,为防治该病毒积累了丰富的资料。但该病毒与寄主相互作用的机制尚不完全清楚。铁氧还蛋白I(ferredoxin I, Fd I)和IP-L是前期工作在烟草体内发现的可以与ToMV CP在体外互作的蛋白,为了进一步了解ToMV与寄主的互作机制,本文对ToMV CP与烟草Fd I及IP-L的互作进行了初步分析。本实验室的前期工作已经发现ToMV CP与铁氧还蛋白I(ferredoxin I, Fd I)可以相互作用。为了进一步确定ToMV CP与Fd 1互作的最小结合域,本文在前期的基础上,利用酵母双杂交技术研究了ToMVCP与Fd I的互作区域。首先,根据预测的Fd I结构域,对烟草Fd I进行分段缺失,分别为Fd△N47、Fd△N71和Fd△N112。勾建至酵母表达载体pGADT7,用酵母双杂交方法分析pGBKT7-CP与缺失片段的互作情况。结果表明,Fd△N47、FdΔN71和Fd△N112均能与pGBKT7-CP互作,其中,Fd△N112和pGBKT7-CP的互作程度较弱。同时,将实验室保存的重组质粒pGBKT7-CP△N31、pGBKT7-CP△N54、pGBKT7-CP△N106分别与pGADT7-Fd I全长进行双杂交,结果显示3个缺失片段均可与Fd I互作。综合以上结果暂确定ToMV CP与Fd I的最小结合域分别为ToMV CP C端含有α螺旋区的54个氨基酸及Fd IC端32个氨基酸。为了确定Fd I与ToMV CP的互作是否特异,本文将实验窒保存的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus,CMV)、薯X病毒(Potato virus X, PVX)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)的CP,分别与Fd I进行酵母双杂交分析,结果表明,TMVCP/CMVCP/PVXCP/TRV CP均能与Fd I互作,说明Fd I与ToMV CP的互作是非特异的。为了进一步确定ToMV CP与烟草Fd I和IP-L在烟草体内的互作情况,本文构建植物表达载体pSPYCE-35S-Fd、pSPYNE-35S-CP和pSPYCE-35S-IP-L,利用双分子荧光互补技术分析了其互作情况。结果表明,ToMV CP与烟草Fd I和IP-L在烟草叶片活细胞内互作。为了检测病毒侵染寄主后,寄主蛋白在植物体内的表达情况,本文构建了IP-L基因的原核表达载体pEGX-IP-L,并导入大肠杆菌BL21中。在37-C培养、1.0mmol/LIPTG诱导条件下表达出融合蛋白3ST-IP-L, SDS-PAGE电泳检测分析表明成功表达出分子质量约为44.6kDa的目的融合蛋白GST-IP-L。以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/1600。用获得抗体进行western blot分析表明该血清具有良好的特异性,可用于检测病毒侵染寄主后寄主蛋白在植物体内的表达情况。