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创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)会导致认知、言语及运动等神经功能的异常,严重则可能致死。由于调控机制复杂,传统的手术、药物及高压氧治疗效果欠佳,因此迫切需求寻找新型的药物或者方法进行干预。干细胞是一类具有自我更新速度快、增殖能力强和可向多种细胞分化的细胞群体。干细胞替代疗法为TBI等神经系统疾病的治疗带来了新的希望。但是进一步研究发现,移植后的MSCs可分化为神经元细胞只有很小的一部分。因此,怎样提高MSCs移植后在损伤部位的存活和神经分化效率是改善MSCs临床治疗效果的关键问题。近些年,在干细胞发育和神经系统疾病防治中,组蛋白乙酰化修饰的功能受到越来越多的关注。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)及其抑制剂在调控胚胎干细胞、神经干细胞、肿瘤干细胞、间充质干细胞等的增殖和定向分化中发挥重要的作用。组蛋白乙酰化修饰参与多种神经相关疾病(如阿尔茨海默病、脑卒中、脑缺血损伤)的发生,使用HDAC抑制剂能够改变损伤部位相关蛋白的组蛋白乙酰化程度,从而发挥神经保护和促神经再生作用。但是,组蛋白去乙酰化酶-1(Histone deacetylase 1,HDAC1)基因修饰与hUC-MSCs移植对于TBI小鼠的协同治疗作用和分子机制还未见明确报道。目的以TBI小鼠模型为基础,经尾静脉移植HDAC1基因沉默修饰的hUC-MSCs评价其对损伤后小鼠认知功能、神经凋亡和神经再生等的影响,并进一步分析PI3K/AKT/GSK3β信号通路在此过程的作用。方法采用立体定位仪和颅脑打击器建立C57BL/6小鼠中度TBI模型,60只小鼠随机分成Vehicle组,MSC组,MSC-siHDAC1组(n=20)。术后0、1、3、7、14、21、28天检测三组小鼠体重变化并采用m NSS评分观察小鼠神经功能缺损症状,通过悬尾、强迫游泳和糖水偏好实验测验小鼠长期运动和抑郁情况,焦油紫(Cresyl violet,CV)染色评估小鼠的脑损伤体积和海马CA3区神经元形态学改变,伊文斯兰(luxol evans blue,EB)染色检测血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)的开放程度,PI染色检测病灶区细胞坏死,二氢乙锭(Hydroethidine,HEt)染色检测损伤周围ROS情况,ELISA检测血清中氧化应激和炎症因子水平,Luxol fast blue染色和脑白质髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)免疫荧光染色评估髓鞘脱失变化,qRT-PCR和免疫荧光检测检测各组小鼠脑内神经相关因子和神经再生相关的表达。Western bolt检测PTEN/PI3K/AKT通路关键因子的表达。最后,利用PI3K的抑制剂--LY294002进行反向研究,明确MSC-siHDAC1是否通过PTEN/PI3K/AKT通路对TBI小鼠神经元发挥神经保护作用结果1、TBI后3天,与Vehicle组相比,MSC移植后可减少TBI小鼠的损伤面积(p<0.05)。EB染色结果显示,MSC-siHDAC1组BBB的开放程度低于Vehicle组和MSC组。术后3天各组小鼠mNSS明显降低,其中MSC-siHDAC1组神经恢复优于Vehicle组和MSC组(p<0.05)。MSC-si HDAC1移植治疗可增加小鼠的糖水偏嗜度并减少小鼠悬浮时间和不动时间,减轻抑郁症状(强迫游泳和悬尾实验),差异具有统计学意义(p<0.05)。2、TBI后3天,Luxol fast blue染色和MBP免疫荧光髓鞘染色结果显示,Vehicle组脑部胼胝体结构错杂,阳性区染色分布异常,纹状体区染色变淡变少(p<0.05)。MSC-siHDAC1组Luxol fast blue和MBP染色阳性区域面积占总面积百分比明显高于Vehicle组和MSC组(p<0.05)。MSC-siHDAC1移植治疗后有利于减少髓鞘损伤(p<0.05)。3、TBI后3天,MSC-siHDAC1移植能减少海马CA3区神经元丢失,阻止神经元退行病变,同时与损伤组相比,各治疗组的Bcl-2和Caspase3蛋白表达升高,Cleaved Caspase3的表达降低,凋亡细胞数目明显减少(p<0.05)。4、TBI后3天,与Vehicle组相比,MSC-siHDAC1增加SOD、GSH和GSH-Px的活性,降低MDA和ROS的含量(p<0.05),增加机体的抗氧化能力;MSC-siHDAC1治疗后,IL-4和IL-10释放量增加,IL-1β和TNF-α释放量减少(p<0.05),机体的抗炎损伤能力提高。5、TBI后3、14、28天,MSC-siHDAC1组神经元标记物Iba1、GFAP、Ki67、DCX、NeuN的表达优于Vehicle组和MSC组(p<0.05)。MSC-siHDAC1移植能调节海马内神经营养因子协同促进海马齿状回神经存活、修复再生(p<0.05),加速其神经功能恢复。6、TBI后3天,和Vehicle组相比,MSC-si HDAC1移植治疗后能使p-PTEN、p-AKT1和pGSK3β水平增加(p<0.05),PI3K、GSK3β和AKT1的总体水平并没有发生变化(p>0.05)。使用抑制剂LY294002抑制AKT通路后,可以部分逆转MSC-siHDAC1的神经保护作用,进一步反向证明MSC-si HDAC1通过激活PTEN/PI3K/AKT通路来发挥神经保护作用。结论1、MSC-siHDAC1移植后改善TBI小鼠的运动功能和认知功能,减少TBI后脑组织缺失,减轻BBB的开放程度、海马神经元变性坏死和髓鞘损伤,改善损伤部位微环境,同时促进小鼠脑内SGZ区的神经再生。因此,HDAC1基因沉默的hUC-MSCs治疗TBI小鼠较单纯的hUC-MSCs治疗有更好的神经保护作用。2、MSC-siHDAC1激活PTEN/PI3K/AKT发挥神经保护作用。