背景和目的:　　Ⅰ型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)是一类包括催化亚基(p110)和调节亚基(p85)的异源二聚体，能够催化磷脂酰肌醇的激酶。PI3K激活后能够催化磷脂酰肌醇产生第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PI-3,4,5-P3)，PI-3,4,5-P3作为第二信使结合并激活多种细胞内的下游蛋白，形成一个信号级联复合物，最终调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等。　　表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，也称为ErbB1，是第一个鉴定出的受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）亚家族成员。受体与配体结合后，EGFR受体自身形成同源二聚体化，进而活化膜内部分的酪氨酸激酶活性，激活下游通路通路，产生生物学效应。EGFR下游的信号通路包括PI3K/Akt信号通路和Ras/Raf/MAPK（ERK，JNK和p38）信号通路。EGFR在多种信号通路和各种细胞功能调控的相互联系中起重要作用。而且EGFR的过表达或者异常激活在细胞增殖、调控细胞凋亡、血管生成和肿瘤转移等一系列肿瘤发生和发展进程中起关键作用。　　EGFR可以激活PI3K(p85α)信号通路，然而调控EGFR表达的靶分子及具体分子机制尚不完全清楚。本研究首次发现p85α可以正调节EGFR表达，促进细胞的恶性转化。p85α究竟通过何种机制正调控EGFR表达还尚不明了，本研究旨在阐明p85α正调控EGFR的分子机制，为今后恶性肿瘤的防治提供新的分子靶点。　　方法:　　1.利用软琼脂克隆形成实验鉴定p85α+/+和p85α-/-在EGF诱导下细胞恶性转化能力的差别，并检测p85α和EGFR对细胞恶性转化能力的影响::　　利用EGF诱导细胞恶性转化的实验模型，用软琼脂克隆形成实验检测p85α在细胞恶性转化中的作用。利用小发夹RNA（shRNAs）在p85α+/+细胞中降低EGFR的表达，并建立稳定转染细胞p85α+/+(shp85α)。利用软琼脂克隆形成实验检测p85α+/+(nonsense)与p85α+/+(shp85α)在细胞恶性转化能力上的变化;利用哺乳动物细胞过表达载体在p85α-/-细胞过表达EGFR，并建立稳定转染细胞p85α-/-(EGFR-GFP)。利用软琼脂克隆形成实验检测过表达EGFR-GFP后对p85α-/-细胞恶性转化的影响。　　2.p85α如何调控EGFR:　　利用RT-PCR实验，确定p85α是否从mRNA水平调节EGFR。利用荧光素酶报告实验，将EGFR基因的启动子序列构建到荧光素酶报告质粒中，检测p85α是否在转录水平调控EGFR。利用放线菌素D(Act D)抑制mRNA的合成，来确定p85α是否影响EGFR mRNA的稳定性。　　3.利用敲减和过表达HUR、Nucleolin质粒检测p85α调控EGFR mRNA稳定性的机制:　　利用蛋白质免疫印迹和RT-PCR检测p85α+/+和p85α-/-细胞中RNA结合蛋白AUF1、HUR和Nucleolin的表达水平。在p85α-/-细胞中过表达HUR，p85α+/+细胞中敲减HUR的表达，并建立稳定转染细胞p85α-/-(GFP-HUR)，p85α+/+(shHUR)，利用蛋白质免疫印迹和RT-PCR检测HUR对EGFR蛋白和mRNA水平的影响。在p85α-/-细胞中过表达Nucleolin，p85α+/+细胞中敲减Nucleolin的表达，并建立稳定转染细胞p85α-/-(GFP-NCL)，p85α+/+(shNCL69)与p85α+/+(shNCL71)，利用Western Blot和RT-PCR检测EGFR蛋白及mRNA的表达变化。利用RNA免疫共沉淀法（RNA IP）检测NCL是否与EGFR mRNA结合。利用放线菌素D(Act D)抑制mRNA的合成，来检测p85α+/+(nonsense)与p85α+/+(shNCL71)细胞中EGFR mRNA的降解速率。　　4.利用软琼脂克隆形成实验检测Nucleolin在p85α介导细胞恶性转化中的作用:　　利用软琼脂克隆形成实验检测p85α+/+(Nonsense)、p85α+/+(shNCL69)和p85α+/+(shNCL71)细胞恶性转化能力的变化，以及p85α-/-(Vector)与p85α-/-(GFP-NCL)细胞恶性转化能力的变化。　　5.p85α如何调控Nucleolin:　　利用RT-PCR检测p85α+/+与p85α-/-细胞中Nucleolin mRNA的表达。利用放线菌素D(Act D)抑制mRNA的合成，来检测p85α+/+与p85α-/-细胞中Nucleolin mRNA的降解速率。利用生物信息学方法预测Nucleolin启动子区域可能存在的转录因子，然后用Western Blot检测p85α+/+和p85α-/-细胞核与细胞浆中各种转录因子的表达水平。　　6.利用C-Jun过表达质粒检测C-Jun对Nucleolin表达的影响:　　在p85α-/-细胞中过表达C-Jun质粒，并构建稳定转染细胞p85α-/-(Vector)和p85α-/-(C-Jun)，利用荧光素酶报告实验检测Nucleolin启动子活性的变化，利用Western Blot和RT-PCR检测Nucleolin蛋白和mRNA的变化。利用软琼脂克隆形成实验检测p85α-/-(Vector)和p85α-/-(C-Jun)细胞恶性转化能力的变化。　　结果:　　1.p85α+/+细胞较p85α-/-细胞恶性转化能力强，EGFR在其中发挥重要作用。　　软琼脂克隆形成实验表明p85α+/+细胞较p85α-/-细胞的恶性转化能力强;蛋白质免疫印迹实验表明p85α+/+中EGFR蛋白显著高于p85α-/-。在p85α+/+中敲减p85α的表达，EGFR也随之降低，敲减p85α的p85α+/+细胞软琼脂克隆形成能力较p85α+/+细胞显著降低，另一方面，在p85α-/-中过表达EGFR能增强其在软琼脂克隆形成能力。这些结果表明p85α能够促进EGFR表达且在EGF诱导的细胞恶性转化中起重要作用。　　2.p85α调节EGFR mRNA的稳定性　　RT-PCR实验表明p85α+/+细胞中EGFR mRNA水平显著高于p85α-/-细胞，在p85α+/+中敲减p85α使EGFR mRNA水平明显下降。荧光素酶报告实验检测EGFR启动子活性，p85α-/-细胞的EGFR启动子活性反而高于p85α+/+细胞，表明p85α不是在转录水平调控EGFR mRNA。mRNA降解速率实验显示p85α-/-细胞较p85α+/+细胞EGFR mRNA稳定性显著下降，这表明p85α+/+能稳定EGFRmRNA水平。　　3.Nucleolin参与EGFR mRNA稳定性的调节　　Western Blot和RT-PCR表明三个RNA结合蛋白HUR、Nucleolin和AUF1在p85α-/-细胞中较p85α+/+细胞较明显降低，因AUF1可促进mRNA降解，故首先排除。在p85α-/-细胞中过表达HUR后EGFR mRNA并没有增高，在p85α+/+细胞中敲减HUR后EGFR蛋白反而增高，这表明HUR不参与调节EGFR mRNA稳定性。Western Blot和RT-PCR实验表明在p85α-/-中过表达Nucleolin后，EGFR蛋白和mRNA表达增高。在p85α+/+中敲减Nucleolin后，EGFR蛋白和mRNA表达降低。染色质免疫共沉淀实验表明Nucleolin确实能够与EGFR mRNA结合，介导其稳定性增加。mRNA降解速率实验显示p85α+/+(shNCL)较p85α+/+(Nonsense) EGFR mRNA降解速率明显加快。以上结果表明p85α通过Nucleolin上调EGFR mRNA的稳定性。　　4.Nucleolin在p85α促进EGF诱导的细胞恶性转化中起关键作用　　软琼脂克隆形成实验表明p85α+/+(shNCL69)和p85α+/+(shNCL71)细胞的克隆形成能力显著低于p85α+/+(Nonsense)细胞;而且，在p85α-/-细胞中过表达Nucleolin后，p85α-/-(NCL-GFP)较p85α-/-(Vector)细胞明显恢复了克隆形成能力。这些结果表明Nucleolin在p85α促进EGF诱导的细胞恶性转化中起关键作用。　　5.p85α调节Nucleolin的转录　　RT-PCR实验表明p85α-/-细胞中Nucleolin mRNA水平明显低于p85α+/+，然后mRNA稳定性实验表明Nucleolin mRNA稳定性在p85α+/+和p85α-/-细胞中只有稍微差别，以上结果表明p85α在转录水平调节Nucleolin。　　6.p85α通过C-Jun来调节Nucleolin的转录　　Western Blot实验检测Nucleolin启动子区域可能结合的转录因子，结果表明p-C-Jun水平在p85α+/+细胞中明显高于p85α-/-细胞，荧光素酶报告实验表明C-Jun能明显增高Nucleolin启动子活性，而且C-Jun能够使p85α-/-细胞中EGFR和Nucleolin的蛋白和mRNA水平增高，过表达C-Jun的p85α-/-细胞恶性转化能力显著增高。这些结果表明p85α通过C-Jun调节Nucleolin转录，并稳定EGFRmRNA最终使EGF诱导的细胞恶性转化能力增强。　　结论:　　本课题率先发现EGFR在p85α+/+和p85α-/-细胞恶性转化能力差异中发挥重要作用，而后我们发现p85α主要通过增加EGFR mRNA的稳定性促进EGFR的表达。通过对RNA结合蛋白的分析，我们确定Nucleolin能结合EGFR mRNA并使其稳定性增加，且Nucleolin在p85α促进EGF诱导的细胞恶性转化中起关键作用。进一步我们发现p85α通过C-Jun促进Nucleolin的转录以及EGFR表达和细胞恶性转化能力增强。总而言之，我们的结果有力地阐明了p85α能够正调节EGFR mRNA稳定性并上调EGFR蛋白表达，最后促进细胞恶性转化。进一步理解了p85α的生物学功能，为今后肿瘤靶向治疗提供新的靶点，及发展新的预防手段提供理论依据。