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脑老化（brain aging）是一种伴随着年岁的增加,大脑的组织形态逐步出现衰退的现象,致使大脑的高级功能的缺失,出现认知功能的障碍。活性氧物质（ROS）是调节细胞的增殖、凋亡等过程中不可或缺的物质。研究表明,氧化还原的失衡,使得活性氧物质ROS生成的增多,激活NLRP1炎症小体,促进了炎症反应,导致了海马神经元的损伤。NADPH氧化酶是体内诱导产生ROS的重要酶系之一,NADPH氧化酶诱导的ROS是否对神经元造成氧化应激,激活海马神经元NLRP1炎症小体,促进炎症反应吸引了众多学者的关注。本课题研究旨在为防治脑老化认知功能障碍寻找新的靶点和思路。第一部分:目的:研究NADPH氧化酶对原代培养海马神经元细胞NLRP1炎症小体的激活的影响和机制,探讨NADPH氧化酶-NLRP1炎症小体在海马神经元衰老与损伤中的作用。方法:1.原代培养海马神经元细胞分别至第6d,9d,12d。DHE染色试剂盒检测海马神经元细胞的ROS生成情况;β-半乳糖苷酶染色测定海马神经元的衰老情况;Hoechst 33258染色测定海马神经元细胞的凋亡情况;免疫荧光检测MAP2的表达;Western blot检测NLRP1,ASC,Caspase-1,IL-1β,NOX2,p47phox,p22phox和RAC1蛋白的表达变化;ELISA检测培养液IL-1β和IL-18的释放量。2.原代培养海马神经元到第6天,随机分成5组:对照组,慢病毒乱序对照组,NLRP1-siRNA转染组（408,883,1372）,作用6天。Western blot观察NLRP1的变化情况。3.原代培养海马神经元细胞到第6天,随机分为4组:对照组,caspase-1抑制剂组,慢病毒乱序对照组,NLRP1-siRNA（408）组,作用6天。β-半乳糖苷酶染色测定海马神经元的衰老情况;Hoechst 33258染色测定海马神经元细胞的凋亡情况;Western blot观察NLRP1、β-Gal的表达变化;ELISA测定培养液IL-1β和IL-18的释放量。结果:1.DHE染色结果显示,与6d组比较,12d海马神经元活性氧物质生成的明显增多;β-半乳糖苷酶染色结果显示,与6d组比较,12d海马神经元细胞衰老明显;Hoechst染色结果指出,与6d组比较,9d和12d海马神经元凋亡数目增加,细胞核裂解成碎块状态;免疫荧光MAP2的结果显示,与6d组比较,12d海马神经元MAP2生成明显减少;Western blot结果指出,与6d组比较,9d和12d海马神经元NLRP1、ASC,Caspase-1,IL-1β,NOX2,p47phox,p22phox和RAC1蛋白的表达明显增加;ELISA结果指出,与6d组比较,12d培养液IL-1β和IL-18的释放明显增加。2.NLRP1-siRNA实验结果显示,与9d组比较,12d海马神经元细胞的转染率增强;Western blot结果显示,NLRP1-siRNA（408）处理组NLRP1蛋白的表达明显减少。3.β-半乳糖苷酶染色结果显示,与对照组比较,caspase-1抑制剂组和NLRP1-siRNA（408）组神经元细胞的老化损伤明显减弱;Hoechst染色结果显示,caspase-1抑制剂组和NLRP1-siRNA（408）组神经元细胞的凋亡比对照组明显减少;Western blot结果指出,caspase-1抑制剂组和NLRP1-siRNA（408）组NLRP1和β-Gal的表达比对照组明显降低;ELISA结果显示,caspase-1抑制剂组和NLRP1-siRNA（408）组细胞上清液中IL-18和IL-1β的释放比对照组明显降低。第二部分:目的:探讨人参皂苷Rg1对原代海马神经元老化损伤的调节及机制,为Rg1防治脑老化认知功能障碍提供理论支持。方法:原代培养海马神经元细胞至第7天,随机分为6组:对照组,H2O2（200μM）组,H2O2（200μM）+Tempol（100μM）组,H2O2（200μM）+Rg1（1μM）组,H2O2（200μM）+Rg1（5μM）组,H2O2（200μM）+Rg1（10μM）组。Tempol（100μM）和人参皂苷Rg1（1,5,10μM）给药6小时后,除对照组外,其他各组给与H2O2（200μM）培养18小时。DHE染色检测海马神经元ROS生成情况;Western blot检测β-Gal,NLRP1,ASC,Caspase-1,NOX2,p22phox和p47phox的表达变化;ELISA测定培养液IL-1β和IL-18的释放量的变化。结果:DHE染色结果指出,H2O2（200μM）组海马神经元ROS的生成比对照组明显增多;与H2O2（200μM）组比较,Tempol（100μM）和人参皂苷Rg1（5,10μM）能明显降低H2O2诱导的海马神经元ROS的生成。Western blot结果指出,H2O2（200μM）组原代海马神经元β-Gal,NLRP1,ASC,Caspase-1,NOX2,p22phox和p47phox的表达比对照组明显增加;与H2O2（200μM）组比较,Tempol（100μM）和人参皂苷Rg1（5,10μM）能抑制H2O2诱导的海马神经元β-Gal,NLRP1,ASC,Caspase-1,NOX2,p22phox和p47phox表达的增加。ELISA结果显示,H2O2（200μM）组海马神经元上清液中IL-18和IL-1β的释放量比对照组明显增高;与H2O2（200μM）组比较,Tempol（100μM）和人参皂苷Rg1（5,10μM）能明显降低海马神经元上清液中IL-18和IL-1β的释放量。结论:实验结果表明,海马神经元在老化过程中,NADPH氧化酶2活性明显增加,ROS的生成增多,NLRP1炎症小体激活,进一步导致了海马神经元的老化损伤,下调NLRP1表达,抑制caspase-1活性可以明显抑制海马神经元的老化损伤。人参皂苷Rg1和Tempol具有抗氧化的功能,能明显抑制NADPH氧化酶的表达,减少ROS的生成,抑制NLRP1炎症小体的表达。表明NADPH氧化酶2介导的ROS的生成可能参与了海马神经元衰老过程中NLRP1炎症小体激活,而人参皂苷Rg1能够抑制NADPH氧化酶2和NLRP1炎症小体的表达,从而对海马神经元的老化损伤具有一定的保护作用。