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防御素是存在多种生物体内的一种小分子肽,具有广谱的抗细菌、真菌、病毒等生物活性,是生物机体天然免疫的重要组成部分。依据相关报道,鸡的体内共存在14种防御素,且均为β-防御素。用乙酸提取的方法从鸡的肠道中分离到的鸡p-防御素13(Gal-13), 具有一定的生物活性,但提取工艺繁琐耗时,且提取量有限。而关于用基因工程方法获得Gal-13的报道相对较少,本研究主要针对鸡Gal-13成熟肽的基因进行了克隆,通过构建Gal-13成熟肽cDNA序列的原核表达载体和真核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21和毕赤酵母X-33中的表达,为进一步研究Gal-13的生物活性和其在畜牧业中的生产应用奠定了基础。1.Gal-13基因序列的扩增及其在大肠杆菌中的诱导表达Gal-13cDNA的全场基因序列为312bp,编码的Gal-13共包括60个氨基酸,其中,信号肽序列为前20个氨基酸,前导肽序列为4个氨基酸,成熟肽序列包括36个氨基酸。依据NCBI中公布的Gal-13(登陆编号：DQ858323)基因序列并借助Primer5软件设计引物,以三黄鸡的肝脏总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增Gal-13的全长cDNA序列,将测序结果经Blast比对后,借助MEGA软件,采用Neighbor-Joining法,与其相关序列进行比对分析并构建系统进化发育树。序列经鉴定分析后设计引物,扩增Gal-13成熟肽,并在序列中引入限制性内切酶BamHI和XhoI的酶切位点,将所得序列与表达载体pGEX-4T-1经双酶切后构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13,并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21进行诱导表达,结果显示Gal-13成熟肽在大肠杆菌中得到大量表达,且最佳诱导表达时间为5h,最佳诱导剂的浓度为0.2 mmol/L, SDS-PAGE和Western-blot检测结果显示,表达的含有GST标签的重组蛋白分子量大小约为30ku,表明Gal-13成熟肽序列在大肠杆菌中得到了成功表达,但主要以包涵体的形式存在,存在于上清中的可溶性目的蛋白较少。2.Gal-13成熟肽基因序列在毕赤酵母中的诱导表达依据Gal-13基因序列重新设计引物,并在其中引入限制性内切酶EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ的酶切位点,扩增Gal-13成熟肽基因序列后进行双酶切,将其插入到酵母分泌表达载体pPICZαA中,,构建重组表达质粒pPICZαA-Gal-13,将鉴定正确的重组质粒,用限制性内梅Sac Ⅰ进行线性化处理后,电击转化毕赤酵母X-33,并利用甲醇对阳性重组菌株进行诱导表达,诱导表达上清用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。结果显示,Gal-13成熟肽基因序列成功插入到表达质粒pPICZaA中且重组质粒成功转化了毕赤酵母X-33,经过鉴定分析,获得了表型为Mut+的高抗性重组菌株,在甲醇的诱导下,Gal-13成熟肽在菌液上清中得到了表达,Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,重组菌株在诱导72h时,Gal-13在上清中得到大量的表达,在5.9ku的位置出现了目的蛋白条带,与预期结果一致,抑菌试验表明,Gal-13对鸡沙门氏菌(CVCC534)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)均具有一定的抑制作用。