论文部分内容阅读
研究背景糖原累积性肌病是一组具有临床和基因异质性的罕见的遗传代谢病,以肌肉病理上出现肌纤维空泡样变性和糖原颗粒沉积为特征,包括10多个类型。糖原累积病II又称为Pompe病,是由编码酸性α葡糖苷酶的GAA基因突变导致,其中晚发型Pompe病以进行性肢体无力及呼吸困难为特征。目前已发现GAA基因突变超过550种,不同人群常见突变位点不同,中国大陆地区目前仅有52例晚发型Pompe病基因突变相关报道。糖原累积病V型是编码肌磷酸化酶的PYGM基因突变导致的,以运动不耐受、肌痛、肌痉挛、肌红蛋白尿为特征,但少数患者临床表现不典型。目前发现PYGM基因突变175种,p.R50X为最常见突变,中国大陆地区仅有2篇相关报道。Pompe病的发病机制包括糖原颗粒沉积导致的溶酶体肿胀破裂、异常自噬、异常线粒体堆积、钙稳态失衡等。其中自噬在Pompe病患者的病理生理过程种起到重要作用,但相关研究较少;而与其有关的炎性机制研究也未见报道。蛋白质组学是研究特定组织细胞在不同发育阶段、不同生理病理状态下或不同环境中全部蛋白质表达和功能的一种高通量技术平台,对于探究疾病的病理生理机制、寻找疾病早期诊断的生物学标志物、探究新的药物治疗靶点有重大意义。Pompe病的发病机制及其作用机理尚不十分清楚,故完整和定量的考察疾病发生发展过程中全部蛋白质表达和功能的改变十分必要,且可以寻找可能的生物学标志物及治疗靶点。研究目的1.分析晚发型Pompe病和McArdle病患者的临床表现、肌肉病理和分子生物学特点,扩展疾病临床表型和基因型。2.探讨自噬和炎性反应在晚发型Pompe病患者肌肉病理中的作用及其机制。3.初探晚发型Pompe病患者肌肉蛋白组学表达变化,寻找可能的生物学标志物。材料与方法1.收集2005年1月至2018年1月在我院确诊为晚发型Pompe病23例,McArdle病2例,归纳分析这些患者的临床和病理改变特点。2.采用二代测序基因芯片技术对致病基因进行检测,分析基因型和临床表型的关系。3.采用免疫组织化学和电镜技术,观察7例晚发型Pompe病患者肌肉组织炎性反应相关抗体的表达和5例患者肌肉组织LC3抗体的表达。4.采用iTRAQ技术,对比3例晚发型Pompe病患者和3例正常患者的肌肉组织蛋白质表达水平,对相关蛋白进行生物信息学分析。结果1.23例晚发型Pompe病患者,男:女=1.6:1,起病年龄1-67.5岁,病程1.5-41年,主要表现为进展性的近端为主的肢体无力,5例患者合并呼吸肌无力。所有患者的肌肉酶组织化学染色提示病变肌纤维内有大小不等的空泡,82.6%的患者空泡内有数量不等的嗜碱性颗粒。14例PAS染色阳性,9例PAS染色阴性,ACP染色示酸性磷酸酶活性增强。2例McArdle病患者起病年龄分别为1岁和38岁,前者表现为运动不耐受17年,后者表现为胸背部灼痛感1月余,运动后加重;CK分别为1620.8U/L和5340U/L;肌肉酶组织化学染色提示病变肌膜下有大小不等的空泡,但空泡内无嗜碱性颗粒。2.在23例晚发型Pompe病患者中,共发现29种GAA基因突变,其中7种为新发突变,即 c.796C>A,c.1057C>T,c.1201C>A,c.1780C>T,c.1799G>C,c.2051C>A,c.2235dupG;错义突变c.2238G>C(18.18%)为最常见突变。2例McArdle病患者分别检测到 PYGM 基因纯合突变,即 c.1081G>A(p.G361R)和 c.142dupA(p.T48fs),后者为新发突变。3.5例晚发型Pompe病患者行LC3免疫组化染色:3例肌纤维严重空泡样坏变的患者中,LC3呈弱阳性表达;2例肌纤维中度空泡样坏变的患者中,LC3在肌纤维中央区域、空泡区呈阳性或小团块状强阳性表达。4.在7例晚发型Pompe病患者的肌肉组织中,4例CD4染色阳性,2例CD8染色阳性,6例CD68染色阳性,4例MHC-I染色弱阳性,2例SRP19染色弱阳性,但7例C5B9染色均为阴性。5.和正常对照组相比,晚发型Pompe病组共检出168种差异蛋白,包括131种上调蛋白和37种下调蛋白;其中与本病相关的主要蛋白有51种线粒体、9种钙离子信号通路和5种自噬相关蛋白。结论1.晚发型Pompe病与McArdle病患者的临床上均有明显异质性,病理上有特征性形态改变;发现晚发型Pompe病患者有7个GAA基因新发突变和McArdle病患者有1个PYGM基因新发突变。2.晚发型Pompe病患者肌肉组织出现自噬现象和轻度的炎性免疫反应。3.晚发型Pompe病患者肌肉组织出现线粒体、自噬和钙离子通路相关蛋白的明显差异表达。