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背景:新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019,COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的一种急性呼吸系统传染病。SARS-CoV-2于2019年12月爆发于中国武汉,后迅速传播引起全球大爆发,截至2022年4月11日,全球感染病例近5亿例,其中死亡病例超过六百万。包括SARS-CoV-2在内的呼吸系统病毒感染已引发多起突发公共卫生事件,对全球人民生命健康和国民经济造成重大威胁。理想的小鼠模型可用于新冠治疗药物疗效评价、疫苗效果测试及新冠致病机制等多方面研究,助力新型冠状病毒肺炎疫情防控。SARS-CoV-2入侵人体细胞的受体为human angiotensin-converting enzyme 2（hACE2）,而小鼠同源受体mouse ACE2（m ACE2）由于氨基酸关键位点差异,不能介导病毒入侵,因此构建COVID-19小鼠模型需要攻克小鼠对SARS-CoV-2天然不易感这一难题。宿主抗病毒免疫反应是一把双刃剑,解析SARS-CoV-2感染机体免疫应答与免疫调控机制有助于临床诊疗与疾病恢复、指导疫苗研发。细胞免疫应答是机体抗病毒免疫应答的重要组成部分,研究表明T细胞在SARS-CoV和MERS-CoV感染中发挥保护作用,阐明其在SARS-CoV-2感染过程中发挥怎样的作用具有重要的意义。目的:本研究旨在快速构建COVID-19小鼠模型,并解析感染小鼠中病毒特异性T细胞的表位取用及功能特征。方法:1.本研究使用Ad Easy系统快速构建重组腺病毒Ad5-hACE2,使用Cs Cl密度梯度离心法纯化Ad5-hACE2,使用斑点形成实验（FFA）测定Ad5-hACE2滴度,并在体外和体内验证hACE2的正确表达与功能。2.通过鼻内滴注Ad5-hACE2的方式转导小鼠,使小鼠肺部高表达hACE2,在转导后第五天感染SARS-CoV-2,从而快速构建腺病毒转导SARS-CoV-2易感小鼠模型。3.通过对比天然免疫通路关键基因缺陷小鼠与野生型（wild type,WT）小鼠感染后的体重下降、肺脏病毒滴度和病理变化等表型的差异,以及Poly I:C处理对疾病的影响来评价天然免疫应答在感染中的作用;通过比较删除T细胞后感染小鼠的表型变化评价细胞免疫在感染中的作用;通过血浆/血清过继转移与瑞德西韦处理后感染小鼠的表型变化评价血浆/血清与瑞德西韦的治疗作用;通过使用表达SARS-CoV-2 S蛋白的VRP疫苗（VRP-S）免疫小鼠评价疫苗免疫的保护效果。综合解析该小鼠模型中抗SARS-CoV-2天然免疫应答、适应性免疫应答、血浆/血清过继转移和药物治疗效果、疫苗保护效果等,进而评价该小鼠模型的应用价值。4.通过淋巴细胞体外多肽刺激结合细胞内细胞因子染色（intracellular cytokine staining,ICS）及流式细胞术的方法,在VRP免疫小鼠和Ad5-hACE2转导SARS-CoV-2感染小鼠中筛选病毒特异性CD4+和CD8+T细胞表位。5.通过检测细胞表面分子表达、细胞内多细胞因子表达能力、对抗原肽的亲和能力、体内杀伤能力解析SARS-CoV-2特异性T细胞的功能特征。6.使用只表达单一T细胞表位的VRP免疫小鼠,在SARS-CoV-2感染后检测小鼠肺脏病毒滴度与病理损伤的变化,进而评价SARS-CoV-2特异性T细胞在感染中的作用。7.对比IFNAR-/-和WT小鼠免疫应答差异,解析I型干扰素（IFN-I）信号对T细胞免疫应答的影响。8.通过序列比对发现三种高致病性人冠状病毒之间保守的T细胞表位,通过保守表位体外刺激淋巴细胞结合ICS的方法验证交叉反应性T细胞应答。结果:1.滴鼻转导Ad5-hACE2的BALB/c小鼠感染SARS-CoV-2后,体重下降约20%、肺脏中SARS-CoV-2病毒滴度高达10~7 PFU/gm、肺脏可检测到SARS-CoV-2 N蛋白、肺脏发生明显病理变化;C57BL/6小鼠在感染后体重下降约15%、肺脏中SARS-CoV-2病毒滴度高达10~7 PFU/gm、肺脏发生明显病理变化。此实验结果表明Ad5-hACE2气道转导SARS-CoV-2感染小鼠模型构建成功。2.使用上述感染模型发现,与WT C57BL/6小鼠相比较,IFNAR-/-C57BL/6小鼠体重降低幅度无明显变化、病毒清除延迟（2 d.p.i.,p=0.0104;4 d.p.i.,p=0.0003;6 d.p.i.,p=0.0023）、肺脏淋巴细胞浸润减少;IFN-（?）-/-C57BL/6小鼠体重变化、肺脏病毒滴度和病理变化与WT小鼠无明显差异;STAT1-/-C57BL/6小鼠体重下降增多、病毒清除延迟（2 d.p.i.,p=0.0289;4 d.p.i.,p=0.0806）、肺部浸润加重。以上实验结果表明IFN-I信号和STAT1信号在SARS-CoV-2感染中发挥保护作用、IFN-（?）信号对小鼠临床表现没有明显影响。Poly I:C处理可以减少感染小鼠的体重下降并加快病毒清除（2 d.p.i.,p=0.0005）,此结果进一步证实了IFN-I信号在感染中的保护作用。小鼠肺组织转录组分析结果显示,转导Ad5-hACE2的小鼠在感染后,肺脏中炎症通路、天然免疫和适应性免疫通路等上调,此结果表明,在SARS-CoV-2感染后,小鼠进入抗感染免疫应答状态。3.SARS-CoV-2感染可以诱导Ad5-hACE2转导小鼠产生中和抗体和特异性T细胞应答。中和抗体水平在10 d.p.i.达到高峰,病毒特异性CD4+和CD8+T细胞在8 d.p.i.达到应答高峰。删除小鼠CD4+（5 d.p.i.,p＜0.0001）和CD8+T（5 d.p.i.,p＜0.0001）细胞后,SARS-CoV-2清除延迟。以上结果表明,在Ad5-hACE2转导SARS-CoV-2感染小鼠中,中和抗体和T细胞均发挥保护作用。4.过继转移VRP-S免疫小鼠血清（1 d.p.i.,p＜0.0001）或者恢复期患者血浆（1d.p.i.,p=0.0021）可以加快小鼠肺脏中SARS-CoV-2的清除;给予瑞德西韦可以加快小鼠肺脏中病毒清除（1 d.p.i.,p＜0.0001）并减轻病理损伤。此实验结果表明在Ad5-hACE2转导SARS-CoV-2感染小鼠中,免疫血清/恢复期患者血浆和瑞德西韦均发挥保护作用。5.VRP-S免疫可以加快小鼠肺脏中病毒清除（BALB/c,1 d.p.i.,p=0.0005;C57BL/6,1 d.p.i.,p＜0.0001）,表明VRP-S免疫在SARS-CoV-2感染中发挥保护作用。6.筛选鉴定出BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠中SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞表位谱。其中,BALB/c小鼠的优势CD4+和CD8+T细胞表位分别是SARS-CoV-2-N351-365（I-Ad）和S535-543（H2-Dd）,而在C57BL/6小鼠分别为ORF3a266-280（I-Ab）和S538-546（H2-Db）。7.SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞应答在8 d.p.i.达到高峰;感染部位病毒特异性T细胞应答强于外周淋巴器官,且能够同时分泌多种细胞因子,对抗原亲和力高,具有体内杀伤功能,表明感染部位病毒特异性T细胞具有多功能性。8.使用表达单一优势CD4+（2 d.p.i.,p=0.0051）和CD8+T（2 d.p.i.,p=0.0026）细胞表位的VRP免疫BALB/c小鼠,在病毒感染后,肺脏病毒清除加速、病理损伤减轻,表明单一表位病毒特异性CD4+和CD8+T细胞在感染中即可以发挥保护作用。9.在IFNAR-/-BALB/c小鼠中,病毒特异性T细胞百分比、细胞数量、分泌多细胞因子的能力、对抗原的亲和能力均较WT小鼠中的弱,表明IFN-I信号缺失减弱病毒特异性T细胞应答及功能。10.在BALB/c小鼠中,SARS-CoV和SARS-CoV-2之间的保守T细胞表位可以诱导SARS-CoV-2感染小鼠呼吸道中的T细胞应答,表明SARS-CoV-2感染诱导的CD4+和CD8+T细胞应答对SARS-CoV存在交叉反应性。结论:1.本研究利用Ad5-hACE2转导小鼠气道成功构建了COVID-19小鼠模型。2.在本小鼠模型中,IFN-I信号、CD4+和CD8+T细胞、免疫血清/恢复期患者血浆、瑞德西韦以及VRP-S均发挥抗SARS-CoV-2的保护作用。3.本研究成功鉴定出BALB/c和C57BL/6小鼠中SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞表位谱,并解析病毒特异性T细胞具有多功能性,单一优势表位特异性T细胞即可在病毒感染中发挥免疫保护作用。4.本研究发现IFN-I信号通路缺失会减弱病毒特异性T细胞应答及功能。5.本研究发现在BALB/c小鼠中SARS-CoV-2对SARS-CoV存在交叉反应性T细胞应答。意义:1.本研究通过气道转导Ad5-hACE2成功快速构建COVID-19小鼠模型。相较于hACE2转基因小鼠模型,此模型构建周期短（2-3周）,不需要特殊繁育,可用于多种基因修饰动物模型构建;且技术方法简单,易于重复,适宜大规模推广。该动物模型可用于抗病毒药物、抗体、疫苗的应急验证及致病机制研究,有效缓解了COVID-19肺炎动物模型缺乏的难题。2.本研究首次在小鼠体内解析新冠病毒感染后病毒特异性T细胞免疫应答特性与功能,此研究将极大推进新型冠状病毒感染细胞免疫应答研究,为SARS-CoV-2致病机制解析、新型疫苗研发以及解析肺脏组织区域免疫特征和疾病等研究提供理论基础和支撑。