聚羟基脂肪酸酯(PHA)因具有很多优良的性能,而被作为一种生物材料应用于医药等很多领域。它是一类碳源和能源的贮藏材料,它们在碳源过剩、其他大量元素(N、O、P、S)被耗尽的情况下,可以由一大类种类各异的微生物合成。PHA是由含有不同碳链长度的单体即3-羟基脂肪酸(3-hydroxyalkanoate, 3HA)聚合而成的。随着目前追求“绿色聚合物”的潮流日益兴盛,PHA作为一类生物可降解,具有生物兼容性的环境友好型材料,已经被用来作为石油基塑料的替代品,而引起广泛的研究兴趣。因为人们对原油价格不断攀升越来越关注,加之石油资源的耗尽和由塑料造成的环境污染越来越严重,PHA的生产与合成就越来越受到研究者和工业领域的关注。目前为止,已经有超过150种的PHA单体组成得以报道。大肠杆菌作为一种模式生物,已经被广泛用来生产各种为人类所用的高附加值产品,如生物燃料、生物材料、大宗化学品等。尽管自然条件下,大肠杆菌无法合成PHA,但是大肠杆菌仍然被认为是PHA合成的理想宿主。用于合成PHA的结构相关碳源即脂肪酸,一般说来,都是高成本,对细胞有毒性,且不溶于水的。因此,很多研究学者们都开始致力于通过整合不同生物体的基因,去发现利用非相关碳源合成PHA的新代谢途径。根据单体中所含的碳原子组成数目的不同,PHA可以被分成三种主要的类型：1.短链长的PHA即scl-PHA,含有3-5个碳原子；2.中链长的PHA即mcl-PHA,含有6-14个碳原子；3.短、中链长单体共聚的PHA即scl-mcl PHA,含有3-14个碳原子。根据PHA的性质,可以在医学领域发挥很大的潜能,如在整形医学方面,可以作为螺丝,软骨组织工程支架,骨移植的替代物。在心血管医学方面,可以作为系统装置如血管替代物、心脏瓣膜、心血管支架、心房和心包间隔的修复补丁。在创伤管理方面,可以用作皮肤的替代物、手术缝合线、医用敷料、隔离剂等。除上述一系列功用之外,PHA还可以作为泌尿支架、纳米或微球用以控制药物的传递。既然PHA具有这么广泛而重要的应用,因此我们更要构建新的PHA高效合成平台,使其能够利用廉价碳源高产含不同链长、不同类型单体的PHA,以适应不同应用领域的需求。传统的scl-PHA如PHB生产应用的是三步法,产量较高,已经用于大规模的工业化生产。而mcl-PHA的生产主要是通过脂肪酸p-氧化和脂肪酸从头合成途径实现的。这两个途径分别有自己的合成缺陷,脂肪酸p-氧化途径是以脂肪酸为碳源来合成PHA。而脂肪酸是一种较昂贵的碳源且对微生物细胞有毒害作用,因此利用该途径合成PHA具有很大的限制。而脂肪酸从头合成途径虽然是利用碳水化合物为碳源生产PHA,但是细胞内积累的PHA含量较低。基于上述的原因,迫切需要构建一个利用廉价、不相关碳源高效生产PHA的平台,从而提供充足的(R)-3-羟酰基-CoA底物。本研究着眼于解决上述问题,在重组大肠杆菌中构建了逆向脂肪酸β-氧化循环中所需酶的过表达质粒,试图直接利用葡萄糖为碳源,通过构建的逆向脂肪酸β-氧化循环,合成含有不同单体的mcl-PHA共聚物。当在单敲除硫酯酶基因的菌株的发酵培养基中添加30gl-1葡萄糖时,敲掉tesB基因的菌株合成的mcl-PHA含量最高,约占细胞干重的4.01%；敲除yciA基因的菌株次之,约占细胞干重的2.04%；敲除tesA基因的菌株合成的mcl-PHA含量最低。同时,我们尝试利用其它廉价、非相关碳源如木糖进行摇瓶发酵试验。结果表明,以30gl-1木糖为唯一碳源时,三种单敲除硫酯酶基因的菌株在转入质粒pQQ05后,均能合成mcl-PHA,产量最高为2.33 wt%,但低于相应菌株以葡萄糖为碳源时的含量。另外,因为在出发菌株的基础上,我们敲除了编码大肠杆菌葡萄糖特异的PTS系统的关键酶即酶IIBC的组分基因ptsG,所以解除了大肠杆菌中的碳源代谢阻遏现象,使得葡萄糖和木糖可以同时被利用。因此,我们又在培养基中同时添加15gl-1葡萄糖和15gl-1木糖作为碳源,在三种单敲除硫酯酶基因的菌株中转入质粒pQQ05进行摇瓶发酵试验,结果表明三种单敲除硫酯酶基因的菌株均能合成mcl-PHA聚合物,且产量均高于单独利用木糖为碳源的mcl-PHA合成量。为了进一步提高产量,本研究在重组大肠杆菌中同时敲除了两个硫酯酶基因,得到双敲除菌株。在LZ05(△tesB△yciA)中转入质粒pQQ05, mcl-PHA含量达到6.62 wt%,在LZ06(AtesBAtesA)中转入相同质粒,mcl-PHA含量达到6.28wt%,而在LZ07(AtesAAyciA)中转入pQQ05积累的mcl-PHA含量最低,约占细胞干重的5.07%。三种菌的生长状况良好,细胞干重均在6gl-1以上。为了得到既含短链单体又含中链单体的PHA即scl-mcl PHA,我们用来自Pseudomonas stutzeri 1317的低底物特异性的PHA聚合酶-PhaC2Ps替换合成mcl-PHA的来自Pseudomonas aeruginosa PAO1的PHA聚合酶-PhaC2Pa,构建了pQQ06质粒。在菌株LZ05中转入pQQ06后,在添加30gl-1的葡萄糖的情况下,能够合成占细胞干重约12.10%的scl-mcl PHA,其中3HB占21.18 mo1%和中链单体占78.82 mo1%。该生产途径可以在经过优化之后用于工业化的大规模生产。上述所有合成的PHA都只是含有偶数链单体的PHA,且已经显示出理想的物理和机械性能,如果在其中增加奇数链单体的组分能够赋予该种生物材料更高的强度和柔韧性,使其更具有新颖性和实用性。鉴于此,就特别需要构建一个高效的PHA生物合成途径,使其能合成含奇数链单体mcl-PHA所需的相应奇数链(R)-3-羟酰基-CoA前体。迄今为止,还没有利用葡萄糖和丙酸在大肠杆菌中积累含有不同长度奇数链单体的mcl-PHA的报道出现。基于这个原因,利用廉价碳源,有功能的逆向脂肪酸p-氧化途径就被用来提供两个碳原子延伸的酰基-CoA前体来合成不同奇数链长的(R)-3-羟酰基-CoA,从而改变仅能添加相关碳源-奇数碳脂肪酸生产奇数链前体的局面。在本研究中,PHA生产的代谢途径包括产生偶数链单体和奇数链单体的两个平行的模块。我们构建了一个能够利用葡萄糖和丙酸产生从C7到C13奇数链单体的mcl-PHA生产途径。为了提供奇数链单体的前体,在本研究中又克隆了来自R. eutropha H16的prpP、prpE和pct基因以及来自E. coli MG1655的aCs基因。将PCR扩增得到的上述4个基因与载体pBBR1MCS2连接,构建了四个质粒,即pZQ01, pZQ02, pZQ03和pZQ04。在构建奇数链前体供给的工程化途径中,可以通过丙酸透过酶(PrpP)摄取丙酸。同时,丙酸也可以直接由丙酰-CoA合成酶(PrpE/Acs)激活或通过丙酰-CoA转移酶(Pct)的作用将3-羟基戊酰-CoA单元插入到延伸的聚合物链中,最后再由从P. aeruginosa PAO1中克隆的编码PHA合成酶的vhaC2Pa将单体聚合生成既含有奇数链单体又含有偶数链单体的mcl-PHA.为了分析基因prpP, acs, prpE和pct对mcl-PHA生产中奇数链单体含量大小的作用,本研究分别共转化质粒pQQ05和pZQ01,pQQ05和pZQ02, pQQ05和pZQ03,pQQ05和pZQ04进入改造的大肠杆菌菌株LZ05中。之所以使用菌株LZ05,是因为其产生偶数链mcl-PHA的含量最高。摇瓶发酵实验是在30℃,250 rpm的转速条件下,加入30gl-1葡萄糖和1.5gl-1丙酸到转化上述组合质粒的重组菌株LZ05培养基中,结果发现都能够积累含有偶数和奇数链单体的mcl-PHA。与其他三个组合的质粒进行比较发现,菌株LZ05含pQQ05和pZQ03积累mcl-PHA的含量最高。此外,工程化构建的含有质粒pQQ05和pZQ01的菌株LZ05合成了占细胞干重大约3.21%的mcl-PHA,而且该菌株含有高达11.24 mol%的最高奇数链mcl-PHA单体产量,其中3-羟基庚酸(3HHp)单体含量约占mcl-PHA的6.46 mmol%。这些结果表明,基因prpP, acs, prpE和pct对mcl-PHA的产量具有不同的影响。根据上述实验结果,该菌株仍然没有足够的分子起始奇数链单体的形成。为了提高重组大肠杆菌中mcl-PHA的产量和拥有更多的奇数链单体,我们通过构建质粒pZQ05, pZQ06和pZQ07,重建了mcl-PHA的生物合成途径。由于过表达prpP时获得了最高含量的奇数链单体,所以在上述质粒中,prpP和acs,prpP和prpE, prpP和pct两两基因同时被分别过表达。然后,它们都是与质粒pQQ05共转化到菌株LZ05中,形成LZ05(pQQ05, pZQ05), LZ05(pQQ05, pZQ06)和LZ05(pQQ05, pZQ07)。培养这些菌株之后发现,它们表现出了不同的生长现象且合成了不同含量的mcl-PHA.在菌株LZ05中共转入双质粒pQQ05和pZQ05时,细胞干重最高可达6.90 gl-1,比用prpP或aCs单基因过表达时的菌株高。然而,当LZ05共转入双质粒pQQ05和pZQ06(或pZQ07)时的细胞干重只达到6.69 gl-1(或6.31 gl-1)。这些结果表明,prpP和aCs的过表达有利于细胞生长。至于mcl-PHA的含量,上述菌株各有不同。LZ05(pQQ05, pZQ06)积累了占细胞干重4.96%的mcl-PHA聚合物,是在上述三种菌株中最高的。然而,在LZ05(pQQ05, pZQ06)中奇数链组分约占10.98%的摩尔百分含量,比LZ05(pQQ05, pZQ01)低。为了进一步提高产量,我们又在LZ05菌株中敲除了poxB和pflB基因,构建了LZ08菌株。将pQQ05和pZQ06质粒转入LZ08,经摇瓶发酵、GC检测,发现该重组菌株能够以30gl-1葡萄糖和2gl-1丙酸为碳源,积累约6.23 wt%的mcl-PHA,其中奇数链单体含量占20.03 mol%。这是迄今为止,首次以葡萄糖和丙酸为碳源合成含有奇数链和偶数链单体的mcl-PHA的报道。