【摘 要】
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猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的高传染性接触性呼吸道疾病。由于APP血清型众多,灭活疫苗缺乏交叉保护,以及耐药菌增多且细菌与细菌/病毒的混合感染严重,特别是“禁抗限抗”政策实施后,PCP及其相关疾病增加,给养猪业造成严重的经济损失。肺脏
【基金项目】
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“国家自然科学基金委”国际合作（重点）项目（No.31520103917），青年基金（32102686）；
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猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的高传染性接触性呼吸道疾病。由于APP血清型众多,灭活疫苗缺乏交叉保护,以及耐药菌增多且细菌与细菌/病毒的混合感染严重,特别是“禁抗限抗”政策实施后,PCP及其相关疾病增加,给养猪业造成严重的经济损失。肺脏是APP感染的重要受损组织,其免疫应答特征的解析是防治的基础。从宿主免疫的角度出发,系统揭示APP诱导的肺脏免疫应答特征,确证疾病发展过程中关键免疫细胞亚群及功能,不仅为APP防治提供新靶点,也为肺脏其他感染性疾病的提供新思路。因此,本研究首先构建了APP感染小鼠模型,通过高通量质谱流式技术联合生物信息学分析,解析了APP感染后不同时间点小鼠肺脏免疫细胞组成与变化。结果显示感染APP后,肺脏的免疫细胞具有极强的异质性,共鉴定表型不同的髓系细胞亚群27个和淋巴系细胞亚群21个。绘制了APP感染后肺脏免疫细胞应答图谱,鉴定特异性的免疫细胞亚群,其中Ly-6G+CD4+T尚未被报道。肺脏中鉴定的17种中性粒细胞亚群,表型聚类为5大群异质性中性粒细胞亚群,其中CD14+中性粒细胞主要富集于肺组织修复期（24 h）,提示CD14差异表达的中性粒细胞群可能与APP感染进程相关。随后,我们使用流式细胞术、单细胞测序技术及生物信息学分析进一步对小鼠和仔猪CD14差异表达的中性粒细胞亚群进行基本特性研究。流式检测小鼠CD14+/-中性粒细胞白介素17A（IL-17A）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ（IFN-γ）、白介素10（IL-10）和白介素21（IL-21）分泌能力及主要组织相容性复合体2类（MHC-II）、CD86和APP的表达能力,相比于CD14-中性粒细胞,CD14+中性粒细胞具有较强的细胞因子分泌能力,可以分泌促炎因子和抑炎因子。CD14-中性粒细胞的抗原提递能力比CD14+中性粒细胞更强。仔猪肺脏细胞单细胞测序分析确证CD14+/-中性粒细胞也存在于APP感染仔猪,并且细胞因子分泌和抗原提呈相关基因表达及Top基因在2群细胞中的GO和KEEG分析得到了与小鼠肺脏中相似的结果。此外,流式检测发现CD14+和CD14-中性粒细胞普遍存在于肺炎克雷伯、大肠杆菌和绿脓杆菌等革兰氏阴性菌感染的肺组织中。为了进一步研究CD14+中性粒细胞功能,我们联合LPS体外诱导CD14+中性粒细胞试验和过继转移方式将CD14+中性粒细胞转移至正常小鼠肺脏,进行APP感染,检测小鼠存活率、临床症状和载菌量,发现CD14+中性粒细胞会在感染早期加重小鼠死亡,抑制对细菌的清除,但感染后期加速小鼠临床症状的恢复,该细胞群在体内可能发挥抑炎作用。最后,免疫细胞的功能受各种免疫分子如细胞因子的调控,由于中性粒细胞表面表达白介素5（IL-5）受体,因此本研究构建了IL-5敲除(IL-5-/-)小鼠APP感染模型,应用流式细胞术、免疫荧光、RT-q PCR、平板涂布检测IL-5-/-和野生性（wild type,WT）小鼠中性粒细胞的杀菌能力、ROS表达、细胞外陷阱（Neutrophil extracellular traps,NETs）释放和杀菌颗粒蛋白m RNA。同时检测IL-5-/-和WT小鼠感染前后肺组织内CD14+/-中性粒细胞亚群数量。结果显示,IL-5缺失小鼠临床症状加重,死亡率升高,对APP感染的抵抗力减弱。进一步研究发现IL-5缺失导致小鼠未感染状况下CD14+中性粒细胞增多,并且通过抑制中性粒细胞NET的形成而不是ROS的产生及杀菌颗粒蛋白来降低中性粒细胞杀菌能力。综上所述,本研究系统解析了APP诱导的肺脏免疫应答特征,构建了APP感染时间特异性图谱,鉴定了感染过程中关键免疫细胞亚群,并揭示CD14+和CD14-中性粒细胞亚群的免疫功能及其IL-5对其的影响,不仅丰富了人们对APP感染免疫应答的认识,也为APP及其相关感染性肺炎的防治提供了新思路。
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