异常黏液质证大鼠模型及药物干预的血清蛋白质组学研究

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目的:筛选异常黏液质证大鼠模型血清差异表达蛋白,以寻找维医异常黏液质证的候选蛋白标志物,明确方药调控靶点蛋白。方法:取90只性功能正常雄性大鼠,从中再随机抽取10只大鼠设为正常对照组(N),余80只为造模组,以湿寒性饲料喂养,按维吾尔医学对环境的要求采用人工气候箱进行造模,至确认已建立稳定的异常黏液质型证候动物模型,通过APO勃起实验和交配实验筛选出均未能成功勃起和交配的大鼠,即阳痿病证模型,随机分为阳痿病证模型组(A1)、阳痿病证药物干预组(A3);其余未成阳痿模型的大鼠,随机分为证候模型组(Bl)、证候药物干预组(B3)。药物干预时间为2周,干预期间全程动态观测其生物学表征,勃起能力和性行为能力。实验终结时,取血清,采用肽段同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)联合液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)技术,筛选差异表达蛋白并对其进行生物信息学分析,并采用酶联免疫吸附(ELISA)方法对部分候选差异蛋白逐一验证。结果:(1)生物学表征观测结果:模型组随着造模时间延长逐渐出现少动,毛发乱无光泽,小便清、淡,大便软不成形,舌苔白腻舌质暗,体重增长缓慢,饮食量显著增多,饮水量显著减少,尿和大便量显著增多等表现。经伊木萨克片对证干预后得到有效改善。(2)APO实验与交配实验结果:模型组造模因素干预后,随着时间延长,勃起潜伏期显著增加,勃起次数显著减少。同时爬背潜伏期、插入潜伏期、射精潜伏期显著增加,而爬背次数、插入次数、射精次数显著减少,经对证维药伊木萨克片干预后,其勃起潜伏期显著减少,勃起次数显著增加,爬背潜伏期、插入潜伏期、射精潜伏期显著减少,而爬背次数、插入次数、射精次数显著增加。(3)iTRAQ检测结果:血清共鉴定出318种蛋白,B1组与N组之间共筛选出76种差异表达蛋白,上调蛋白51种,下调蛋白25种;B3组与N组之间共筛选出77种差异表达蛋白,上调蛋白57种,下调蛋白20种;根究生物信息学分析,并结合文献研究确定证候模型组候选标志性蛋白33个,上调25个,下调8个;证候药物干预组候选标志性蛋白23个,上调21个,下调2个。(4)ELISA结果:CRP、β2GP1浓度在B1组显著高于N组(P<0.05)、B3组与N组之间无统计学差异(P>0.05),B3组显著低于B1组(P<0.05);α1-AGP、RBP4、AGT浓度在B1、B3组均显著高于N组(P<0.05),B3组显著低于B1组(P<0.05);IGF1、GPX1浓度在B1、B3组均显著低于N组(P<0.05),B3组显著高于B1组(P<0.05)。结论:(1)成功复制维医异常黏液质型证候和阳痿病证大鼠模型,其生物学表征与维医临床高度吻合,同时可见其随建模因素影响的时间延长,逐步出现性功能降低,性行为能力减退,并进一步证实了该模型的可靠性、科学性与稳定性。(2)通过本研究,初步确定了33种异常黏液质证大鼠模型血清候选差异蛋白与23种药物靶点候选差异蛋白。(3)通过在动物血清中验证,得出CRP、β2GP1、α1-AGP、RBP4、AGT和IGF1、GPX1为异常黏液质证的血清候选蛋白标志物,其中CRP、β2GP1、α1-AGP、RBP4、AGT的上调,IGF1、GPX1的下调,可能是异常黏液质证发生发展的关键环节,可能成为异常黏液质证候疾病蛋白质标志物,但需在临床患者血清中进行验证后,方可最终得出结论。(4)在异常黏液质证的发生发展中,慢性炎症和代谢功能改变可能发挥着关键性的作用,但需要在临床验证上述候选蛋白质基础上,进一步开展候选蛋白标志物的功能网络研究,来进一步揭示慢性炎症和代谢功能改变在该证候发生发展中的作用。(5)伊木萨克片作为治疗异常黏液质型阳痿、早泄和少弱精症的经典维药,它的作用模式可能为多靶点调控机制。其中CRP、β2GP1、RBP4、α1-AGP、AGT、GPX1、IGF1等7个蛋白不仅是该证候的候选标志蛋白,同时亦可能是伊木萨克片治疗异常黏液质型疾病的作用靶点之一。
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