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6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是降脂类特效药阿托伐他汀的关键手性中间体,市场需求量大。由于酶法不对称还原反应具有反应条件温和、转化率高以及立体选择性好等优点,已成为药物合成的重要工具。本文研究了6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的全细胞催化工艺,并进行年产200吨工艺设计。首先通过通气比相等的放大原则,成功将发酵工艺条件从实验室5 L规模发酵罐放大到50 L、500 L和5000 L规模的发酵罐。随后,在5000L发酵罐上进行了工艺条件优化,得到如下参数:一级种子(摇瓶)种龄7~9 h,二级种子(50 L罐)种龄3~5 h,三级种子(500 L罐)种龄2~3 h,发酵用水选用自来水,甘油选用工业甘油,接种量5.0%,装液系数0.6(v/v),乳糖浓度15.0 g/L。在此培养条件下,当培养到12 h时,各项指标达到最高:最高生物量为12.7 g DCW/L,最高比酶活为1387.7 U/g,最高体积酶活为17628.2 U/L。选择全细胞E.coli BL21/pET28a-cr与全细胞E.coli BL21/pET28a-gdh双菌双酶协同作用方式,催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯,对其催化工艺条件进行了研究,得到最适催化条件:6.5 g/L三乙醇胺缓冲体系,6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯与葡萄糖质量比为1:0.75(w/w),维持反应pH值6.0~7.0,温度控制30~32°C,E.coli BL21/pET28a-cr与E.coli BL21/p ET28a-gdh双菌质量比为2:1(w/w),菌体总浓度15.0 g DCW/L。在该条件下,最高可催化300 g/L浓度底物,7 h使底物完全转化,d.e.值大于99.5%。另外,研究表明发酵液直接催化对反应没有明显的抑制作用。通过探索底物的补料工艺,得到底物的分批补料工艺为:初始底物浓度100 g/L,40 min时补入100 g/L,2 h时补入100 g/L,4 h时补入100 g/L,6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度和葡萄糖同时等量补料,最终底物浓度约400 g/L,6 h时底物完全转化。底物的连续补料工艺为:初始底物浓度100 g/L,当底物转化率达到99%后,开始流加底物,通过控制蠕动泵转速,使流加速度约为75 g/L·h,在4 h内把6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和葡萄糖同时完成补料,最终体系中6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和葡萄糖终浓度均约为400 g/L,底物完全转化所需时间为6 h。最后,依据上述实验数据,按照经验放大模式,进行了年产200吨6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的工艺设计。