Werner综合征（Werner syndrome, WS, OMIM catalog#277700）又名成人早老征,是1904年由Otto Werner首先报道,以过早衰老为特征性表现的一种罕见的常染色体隐性遗传性（Autosomal recessive,AR）疾病。本病被研究者认为是“人类老化的天然基因模型”。WS临床谱很广,患者幼年身体和智力发育相对正常,10～18岁出现生长停滞,其临床表现主要发生在4个系统：结缔组织受累发生率100%,出现年龄27±10岁,表现为特殊的面容和体形、皮肤硬化、灰白或稀疏头发、骨质疏松、白内障和透明质酸尿等；内分泌和代谢系统异常发生率80%,出现年龄36±9岁,表现为糖尿病、性腺功能减退、甲状腺功能异常、高脂血症等；免疫系统受累发生率80%,出现年龄40±10岁,表现为自身抗体产生导致自身免疫性疾病；神经系统受累发生率50%,出现年龄40±10岁,表现为脑萎缩、老年性痴呆和精神分裂症等。其中皮肤溃疡出现年龄34.7±9.6岁。患者平均寿命为54岁,约50%的患者死于恶性肿瘤或者由于动脉粥样硬化所致心肌梗死或脑梗死而死亡。本病罕见,通过清华同方CNKI数据库搜索国内2010年之前的期刊文献共有10例病例报道,于1983年首例报道。全世界1916-2002年总共报道1300例,其中日本报道1000余例,以日本的近亲联姻后代中的WS患者发病率较高,日本发病率达1/10万,而其他地区为1/100万～1/1000万。近十年内可以查询到完整资料的7例患者中有1例儿童及6例成人,其中父母为近亲结婚者2例,患者家族中有类似患者的有2例,儿童患者以不能下蹲就诊,6例成人患者均患有白内障,其中5例以足部溃疡就诊,1例以脑膜瘤引起左面部麻木就诊。本例患者无典型WS患者所具有的双侧白内障,而仅患有翼状胬肉,双眼虹膜萎缩等,且无伴发常见的糖尿病,伴有神经性耳聋,属于罕见类型。查阅国外文献,仅法国学者Uhrhammer等研究论文中有1例无白内障,伴有听力下降拟诊的WS患者。伴有神经性耳聋WS病例在国内属首次报道。WS国际注册网站提供的诊断标准如下：主征：（10岁以后发生）①白内障（双眼）；②典型皮肤病变（皮肤变薄,硬化,色素样改变,溃疡,过度角化,局部皮下萎缩）“小鸟”样面容；③身材矮小；④双亲近亲婚配史（三代以内表亲）或受累同胞；⑤早老和/或秃发；⑥24小时尿玻璃酸试验阳性。次征：①糖尿病；②性腺机能减退（第二性征缺如,不育,睾丸或卵巢萎缩）；③骨质疏松;④肢端骨样硬化（X光片）；⑤软组织钙化；⑥早发动脉粥样硬化的证据（如：心梗史）；⑦间质肿瘤；⑧声音改变（声嘶,声锐）；⑨扁平足。确诊：所有主征加两个次征。拟诊：前三个主征加两个其他条件。疑诊：白内障或皮肤病变加其他四个条件。排除：青春期前即出现相应症状,体征（身材矮小除外）。本病主要与以下几种皮肤衰老和或伴有耳聋及网状色素沉着等表现的疾病相鉴别诊断：系统性硬皮病、肢端老化症、核纤层蛋白病（包括早老症、下颌骨肢端发育不良、非典型WS、伴有类早老表现的早发型肌肉营养不良症等）、变形性早老症、Rothmund-Thomson综合征、Bloom综合征、KID综合征、Cockayne综合征、共济失调-毛细血管扩张症、先天性角化不良等。本病临床谱很广,伴感音性神经性耳聋特殊类型的Werner综合征更为罕见,该病基因型与表现型的关系尚不甚明确。WRN致病基因定位于8p11.1-p12.1,全长5.2kb,包含35个外显子,编码1432个氨基酸。http://www.pathology. washington.edu/research/werner/database/数据库目前已发现WRN基因突变位点有85个之多,包括碱基替换、缺失、插入及非同义SNP等,30个外显子的编码区和剪接位点均有突变基因的发现。双等位基因突变大约占90%,最常见的突变类型是c.1105C>T,在欧洲和日本占20%-25%。国内学者Zhao等报道1例31岁男性患者,伴有白内障,尚无糖尿病,DNA测序发现一新WRN基因突变25号外显子c.3250delG,导致合成蛋白缩短,从而降低了解旋酶的活性。郝淑煜等报道1例伴发脑膜瘤患者,发现18号外显子c.2806insA,为一新杂合突变。台湾学者Yeong等报道2例26、28岁的亲姐妹患者,伴有白内障,尚无糖尿病,DNA测序发现WRN基因突变3264-5delAG。查阅国外文献,仅法国学者Uhrhammer等研究论文中有1例无白内障,伴有听力下降拟诊的WS患者,该患者WRN基因突变为c.3496A>T,导致p.Lys1166>X。伴神经性耳聋Werner综合征的基因突变研究在国内尚属首次。WRN蛋白是DNA解旋酶RecQ家族成员之一。人类保守RecQ家族还包括RecQ1,BLOOM综合症的蛋白（BLM）,Rothmund-Thomson综合症的蛋白RecQ4,和RecQ5。3个RecQ解旋酶家族的缺陷,包括RecQ4, BLM和WRN （RecQ2）,可以导致人类肿瘤易感性和过早老化的病理学变化。WRN基因突变导致沃纳综合征。WRN是最有特征性的RecQ解旋酶家族成员,包括RecQ解螺旋结构域和N端的核酸酶结构域等,既有解旋酶活性,又有核酸外切酶活性。已知的功能包括参与DNA复制和修复、转录、染色体端粒的维护等。体外和体内研究都表明,WRN的功能通过翻译后修饰以及一些重要的蛋白质之间的相互作用来表现,其功能障碍可导致体细胞中基因组不稳定状态。Werner综合征的基因型和表现型间的关系复杂,具有遗传异质性。建议患者保持良好的生活习惯,定期检查,防治可能发生的并发症如动脉粥样硬化及各种恶性肿瘤等。目前大多数遗传病无法治愈,通过研究希望为今后的遗传疾病的诊断和治疗提供有益参考。目的1.分析该病的组织起源、临床表现、鉴别诊断、治疗方法及预后等,提高对国内首例特殊表型Werner综合征的认识。2.建立一种简单快速的逆转录聚合酶链反应方法分析WRN基因突变,初步探讨本例Werner综合征的分子病因及发病机制。资料与方法患者及家属签署知情同意书,临床及试验研究符合《赫尔辛基宣言》。1.收集本例患者详细临床资料,完善各系统筛查、实验室检查,复习文献资料,完成临床诊断和鉴别诊断,附病例报告：患者男,38岁,未婚。双足多发性溃疡,疼痛半年。本例患者临床特点如下：①中年男性,青春期前后发病。②主要临床表现为足部多发性皮肤溃疡迁延不愈,身材矮小消瘦,皮肤皮革样硬化,白发。③8年前曾行左足溃疡植皮术,近年来双耳听力下降,嗓音细高,轻度声嘶。④体格检查：可见大量白发,面部皮下脂肪萎缩呈“小鸟样”面容,假性眼球突出,右眼内眦结膜处可见白色翼状胬肉,鼻口皮肤缩窄呈喙状鼻,口周放射状沟纹,牙列不齐并突出,无胡须及喉结。肩胛带,骨盆带,四肢皮下脂肪,肌肉萎缩硬化,呈皮革状不能捏起。双足背,足跟踝处多处溃疡,表面结痂,扁平足。外生殖器阴茎阴囊幼稚未发育,未见阴毛腋毛。全身皮肤干燥,颈部皮肤弥漫性网状色素沉着,双下肢伸侧色素沉着,类似鱼鳞病样斑片状皮损,少量脱屑。⑤实验室检查：睾酮（T）：0.382ng/mL仅为男性7-12岁水平；腹部B超：前列腺测值小；骨密度测定：骨质疏松；电测听：双侧中重度感音性神经性耳聋；泪腺分泌试验：左1mm/min,右3mm/min （干眼症）。综上,患者具有特征性的“小鸟样”面容；皮肤老龄化改变,白发是早老的表现；肩胛带,骨盆带,四肢皮下脂肪,肌肉萎缩硬化,呈皮革状不能捏起,呈硬皮病样皮肤改变；无胡须及喉结,外生殖器幼稚,未见阴毛腋毛,伴有睾酮水平低下及骨质疏松等内分泌代谢系统异常。Goto等在2000年修订了WS临床诊断标准,具体为35岁以下,出现以下5个标准中的4项即可明确诊断。①近亲结婚；②特征性的鸟形或面具形脸和体型；③早老特征；④硬皮病样皮肤表现；⑤内分泌代谢系统异常。本病例符合后4条,临床诊断为Werner综合征。患者临床表现复杂,伴有神经性耳聋,声嘶,右眼翼状胬肉,双眼虹膜萎缩,泪腺分泌功能下降,扁平足而无糖尿病及白内障,拟诊为一新型伴神经性耳聋Werner综合征。2.收集本例患者及3例正常同龄健康对照皮肤组织,收集患者及其家属、正常健康对照30例静脉血标本。3.WRN基因突变筛查建立简单快速的逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）方法分析WRN基因突变,原理是：提取血液细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo （dT）利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,然后采用ABI.PRISM3700自动测序仪直接测序。利用Chromas软件（2.23版本）和Clustalx软件分析测序结果与WRN基因的cDNA序列（GenBank登录号：NM₀00553.4）进行比对以发现可能突变位点。提取血液细胞中DNA,对于发现的可疑突变位点的所在外显子进行引物设计并合成,通过普通聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）方法进行扩增,然后采用3730XL型DNA测序仪直接测序。利用Chromas软件（2.23版本）和Clustalx软件分析测序结果与WRN基因的DNA序列（GenBank登录号：NC₀00008.9）进行比对,验证突变位点。具体步骤如下：3.1外周血总RNA提取及cDNA测序：3.1.1对患者及其家属2份抗凝静脉血样品RNA抽提3.1.2反转录3.1.3引物设计合成3.1.4PCR体系优化并扩增3.1.5PCR产物纯化3.1.6PCR纯化产物测序3.2外周血DNA提取及DNA测序验证：3.2.1患者及其家属2份及30份正常健康对照抗凝静脉血样品DNA抽提3.2.2引物设计合成3.2.3PCR体系优化并扩增3.2.4PCR产物测序4.生物信息学分析验证通过互联网数据库（如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank等）,进行序列比对分析试验结果。5.荧光定量PCR检测分析对患者及3例正常同龄健康对照皮肤组织样品做RNA抽提,反转录,PCR体系优化,PCR扩增及测序,以GapDH为内参,检测WRN基因的mRNA表达量,试验重复三次,得到一致结果。5.1确定基因序列和目标种属5.2设计合成引物5.3提取皮肤组织RNA,反转录合成cDNA并进行PCR扩增。5.4构建2个基因的质粒标准品5.5绘制2个基因的标准曲线5.6对3个样本2个基因位点进行SYBR法qPCR检测5.7数据分析6.免疫组化法检测WRN蛋白表达以免疫组化法检测患者及3例正常同龄健康对照皮肤组织样品的WRN蛋白表达,试验重复三次,得到一致结果。结果1.本例患者符合Goto修改的WS临床诊断标准,除此外伴有神经性耳聋,右眼翼状胬肉,双眼虹膜萎缩,泪腺分泌功能下降等,而无糖尿病及白内障,临床诊断为一新型伴神经性耳聋Werner综合征,为国内首报。2.使用逆转录聚合酶链反应成功对国内首例新型Werner综合征进行基因突变分析,分析WRN基因的cDNA测序结果以及DNA测序结果验证发现,患者WRN基因有4处碱基改变：exon20c.2361G>T和exon27c.3237G>A、内含子2967+237A>G和3309+26C>T。这些变异是人群中存在的单核苷酸多态性（SNP）,其中外显子cSNP在国外已有报道。3.实时荧光定量PCR结果显示：患者皮肤组织中WRN的表达量与正常同龄健康对照相当。患者WRN基因在mRNA水平上没有发生明显变化。4.免疫组化检测患者皮肤组织WRN蛋白表达,与正常同龄健康对照未发现表达明显差异。结论1.发现并临床诊断国内首例伴神经性耳聋且无糖尿病及白内障Werner综合征。WS极为罕见,临床谱很广,表现多样,本例特殊表型的Werner综合征的临床研究报道丰富了国内遗传性皮肤病资源。2.逆转录聚合酶链反应可以简单快速地检测分析WRN基因突变,可大大节约基因突变检测费用成本,值得在临床已知单基因遗传病基因突变验证分析试验中推广使用。3.本例Werner综合征未发现WRN基因外显子的致病性突变,进一步证实Werner综合征的基因型和表现型间的关系非常复杂,具有遗传异质性。4.研究本例患者皮肤组织,在mRNA水平和WRN蛋白表达方面,与正常同龄健康对照相比无明显异常,其发病可能其它因素导致。