研究背景急性胰腺炎是胰腺的一种炎症性疾病,有多种致病因素且在临床上的症状呈多样性。急性胰腺炎的发病是由于在某些病理情况下胰腺中的原酶(尤其是胰蛋白酶)被异常激活,导致胰腺自身消化,从而诱发急性胰腺炎。急性胰腺炎对机体正常生理扰乱大,对各重要脏器损害明显,故死亡率甚高,目前尚无特异性治疗措施。新近研究表明胰腺腺泡细胞内钙过载是急性胰腺炎早期大量释放胰酶的重要细胞机制,因此,药物干扰细胞内钙信号可能成为一种新的治疗急性胰腺炎的手段。大麻素受体家族中的大麻素受体2(CB2R)是一种G蛋白偶联受体。已有研究表明,激活CB2Rs可以缓解疼痛并对抗炎症,且CB2R激动剂可以有效地改善急性胰腺炎所造成的胰腺腺泡细胞的病理改变。然而,在生理或病理情况下,CB2Rs是否参与调控胰腺腺泡细胞内钙信号仍不清楚。本实验利用乙酰胆碱(ACh)诱发的胰腺腺泡细胞内钙信号振荡为模型,结合CB1R和CB2R基因敲除小鼠,研究CB2R激动剂对胰腺腺泡细胞内钙信号的调节及机制,为应用大麻素类物质治疗急性胰腺炎提供重要的实验依据。实验方法(1)小鼠胰腺腺泡细胞分离根据以前报道的方法略加修改分离得到单个的胰腺腺泡细胞。取3-5月龄小鼠(CD1野生型,C57BL/6野生型或者CB1R、CB2R敲除小鼠)在异氟烷麻醉下,迅速取出胰腺,将胶原酶液(150-200U/m1)处理后分离备用。通常,分离好的细胞在室温下进行(21±1℃)可存活3个小时以上。(2)膜片钳全细胞记录和打孔记录根据以前报导的研究方法,用传统的全细胞膜片钳或者膜片钳打孔记录方法记录神经递质(如乙酰胆碱,ACh)诱发的钙离子依赖性氯离子电流,从而间接测试细胞内的钙离子浓度的变化(钙振荡)。(3)免疫细胞组化细胞被固定之后在进行阻断、孵育、冲洗、再孵育、冲洗、包埋、封盖等步骤后用CB2R抗体进行免疫组化染色,于荧光显微镜采集相片以观察CB2R蛋白的表达。(4) Real-time PCR取分离好的胰腺腺泡细胞用Real-time PCR检测CB受体mRNA的表达。(5)激光共聚焦显微镜取适量胰腺腺泡细胞悬液于载物盘上,待细胞贴壁后,用染料Fluo-4负载20min,设置共聚焦参数,用共聚焦的连续扫描模式记录腺泡细胞内的钙振荡。(6)整体实验动物分组整体实验动物分为3组：1)小鼠分为空白对照组,2)急性胰腺炎模型组,和3)GW(CB2R选择性激动剂)急性胰腺炎治疗组。急性胰腺炎模型组小鼠用左旋精氨酸在进行腹腔注射(4mg/kg,两次),于最后一次打完药之后24h处死动物,采集血样、胰腺和肺脏。血样分离出血清后测试淀粉酶、肺脏用于测试髓过氧化物酶(MPO)。胰腺的一小部分用于HE染色观察病理改变,另一部分可用于分离腺泡细胞进行共聚焦显微镜记录。(7)统计学分析所有数据以均数±标准误(X士S)表示,采用SPSS17.0统计分析软件进行数据处理。如果所分析的数据来自同样的样本则用配对t检验,如果数据来自不同的样本,则用非配对t检验。多组比较时用One-way ANOVA. P<0.05为有统计学意义。实验结果(1)CB受体激动剂对ACh诱导的钙振荡的作用在膜片钳全细胞电压箝记录条件下可以记录到持续浴液灌流10nM ACh引起的钙振荡反应,表现为持续内向氯离子电流振荡。待钙振荡反应稳定后(通常约3min),灌流10μM GW3min明显抑制钙振荡反应,当冲洗掉GW后,钙振荡可以恢复。用激光共聚焦钙成像方法观察到100μM GW亦可抑制100nM ACh引起的钙振荡反应。结果表明,激活胰腺腺泡细胞的CB2Rs可以抑制ACh引起的胞内钙振荡反应。(2)GW抑制ACh诱发的钙振荡呈浓度依赖关系在ACh引起的持续钙振荡反应的基础上,加入GW1μM、10μM、100μM之后与前对照相比钙振荡的标准化净电流比较,钙振荡反应依次被减少至88±15%(n=6,p>0.05),51±4.4%(p<0.01,n=8)和12±1.1%(p<0.01,n=4)。(3)GW抑制ACh诱发的钙振荡是通过选择性激活CB2Rs同时使用选择性CB2Rs拮抗剂,AM630(0.1μM和GW(10μm)可以消除GW对10nMACh引起的钙振荡的抑制作用,而单独使用AM630(0.1μM)对ACh引起的钙振荡则没有影响。10μM GW对30nM ACh引起的钙振荡的抑制作用在CB2R敲除的小鼠上不存在,但这个抑制作用在CBlR敲除的小鼠上存在。而后,还发现CB1R的选择性激动剂(10μMACEA)对10nM ACh引起的钙振荡没有影响。(4)GW通过细胞表面的CB2R来抑制ACh引起的钙振荡将IP3(30μM)加入到到电极内液,当形成传统的膜片钳全细胞记录时,IP3进入到了细胞内且能引起钙振荡。实验结果发现GW对IP3引起的钙振荡没有抑制作用。此外,从细胞内给予GW(100μM)对ACh引起的钙振荡也没有抑制作用。用同样的方法,我们从细胞内给予CB2R的拮抗剂(AM6301μM)也不能消除浴液施加GW对钙振荡的抑制作用。这些结果显示GW对细胞内钙振荡的抑制作用是通过细胞外细胞膜上的CB2R来调节的。(5)急性胰腺炎的诱导剂左旋精氨酸对ACh引起的钙振荡的影响在从正常小鼠身上分离得到的单个胰腺腺泡细胞上,持续给予左旋精氨酸10分钟可以明显增强ACh引起的钙振荡,且这种增强效应在左旋精氨酸被冲洗后不能逆转。在体实验模型中,激光共聚焦成像记录结果显示与注射生理盐水的在同一时间处理的小鼠相比,注射左旋精氨酸24小时后的小鼠的细胞内钙振荡明显增强。(6)GW能减弱左旋精氨酸对钙振荡的增强作用以及对腺泡细胞的病理改变在分离得到的胰腺腺泡细胞上,使用左旋精氨酸的同时加上GW(10μM)可以消除左旋精氨酸对钙振荡的增强作用。在小鼠整体实验当中,在注射左旋精氨酸的前30分钟注射GW也能阻止左旋精氨酸引起的钙振荡增强作用。在急性胰腺炎的小鼠模型中,在注射左旋精氨酸前预注射GW,可以降低淀粉酶(AMS)和髓过氧化物酶(MPO)(7)CBl受体和从CB2受体mRNA在小鼠胰腺腺泡上的表达利用RT-PCR技术探测到CB2R mRNA在小鼠胰腺腺泡细胞有高表达,而CB1R mRNA在胰腺腺泡细胞上没有表达。(8)CB2受体蛋白在小鼠胰腺腺泡上的表达利用CB2R抗体进行免疫组化染色,发现小鼠胰腺腺泡细胞大多呈阳性反应,表明小鼠胰腺腺泡细胞上有CB2受体蛋白表达。结论：1.选择性CB2R激动剂(GW)可激活胰腺腺泡细胞表面的CB2Rs从而抑制ACh引起的细胞内钙振荡,且这个抑制效应呈GW浓度依赖性。2.GW引起的抑制效应可被CB2R的拮抗剂阻断,且这种抑制效应在CB2R敲除小鼠中消失,但在CBlR敲除小鼠中仍存在。3.左旋精氨酸可增强ACh引起的钙振荡,且这个增强效应可以被CB2R的激动剂(GW)消除。4.CB2R激动剂可以改善急性胰腺炎(由左旋精氨酸诱导)的病理变化,其机制之一是抑制了超载的胰腺腺泡细胞内钙信号的。5.因此,胰腺腺泡细胞的CB2Rs可能是一种治疗急性胰腺炎新靶点,而降低细胞内钙震荡则是一种新的治疗急性胰腺炎的细胞机制。