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第一部分 HPV多重感染在宫颈癌发生发展中的作用[目的]分析正常人群(对照组)和宫颈癌组患者的HPV亚型感染的临床分布特点,探讨HPV多重感染在宫颈癌发生发展中的作用。[方法]按照知情同意的原则,收集2013年9月至2015年12月到昆明医科大学第三附属医院妇科住院接受治疗的宫颈癌女性患者组织标本224例,并选择同期到妇科门诊体检的女性宫颈分泌物标本1011份作为对照组。提取组织及宫颈分泌物DNA,用HPV-DNA导流杂交基因芯片技术进行HPV分型检测,了解HPV亚型感染情况,分析正常人群(对照组)及宫颈癌与HPV分型感染情况的关系。[结果](1)本研究1011例对照组HPV基因分型检测结果显示,HPV阳性135例,总的感染率为13.35%,HPV感染亚型主要为：HPV52(3.17%)、HPV16 (2.67%)、HPV58(1.68%)、HPV18(0.99%)、HPV39(0.89%),其中单一感染率排前3位的是HPV52 (2.37%)、HPV16 (1.98%)、HPV58(1.19%);多重感染率排前3位的是HPV52 (0.79%)、HPV16(0.69%)、HPV58 (0.49%)(多重感染按感染亚型重复计数)。而在224例宫颈癌组织中,HPV阳性216例,总感染率为96.43%,主要感染亚型为：HPV16(86.61%)、18(19.64%)、31(4.46%)、51(3.13%)、58(3.13%),其中单一感染中前3位的是HPV16(59.82%)、18(3.57%)、58(1.34%)；多重感染中前3位的是HPV16(26.79%)、18(16.07%)、31(3.57%)。(2)对所有对照组及宫颈癌组分六个年龄段进行统计分析,对照组各年龄阶段(21岁以下、21-30岁、31-40岁、41-50岁、51-60岁,61岁及以上)HPV阳性率分别为：0.40%、3.76%、4.95%、3.36%、0.69%、0.18%。宫颈癌组中各年龄阶段(21岁以下、21-30岁、31-40岁、41-50岁、51-60岁,61岁及以上)的HPV阳性率分别为：0.00%、6.25%、24.11%、36.16%、23.66%、6.25%。对照组及宫颈癌组均呈单峰分布,对照组的HPV感染高峰期分布在31-40岁年龄段,而宫颈癌组的HPV感染高峰期分布在41-50岁年龄段,较对照组的高峰期年龄段延后10年。(3)在本研究中发现在对照组中多重感染率为2.47%(25/1011),宫颈癌组为27.68%(62/224),且宫颈癌组的多重感染均为高危型HPV的混合感染,且多重感染率在21-30岁、31-40岁、41-50岁、51-60岁年龄段对照组与宫颈癌组间均差异显著(P<0.001),有统计学意义。多重感染主要是双重感染22.77%(51/224),而在双重感染中又以HPV16+18型多见,占双重感染的52.94%(27/51),其次为HPV16+31型(9/51,17.65%)。[结论](1)本研究显示随着宫颈病变程度的增加,HPV亚型分布有所变化。在宫颈癌患者中最主要的HPV亚型为HPV16和18型,提示如妇女行宫颈癌筛查时发现HPV16和18阳性,必须积极随访,及时干预、治疗,以防止其进展为宫颈癌,此外,HPV 16、18型二价或HPV 16、18、6、11型四价疫苗对本地区潜在预防能力较强。(2)本研究HPV感染随年龄的变化呈单峰分布,宫颈癌组的HPV感染高峰期分布在41-50岁年龄段,较对照组的年龄段延后10年。因此围绝经期及绝经期妇女查出高危型HPV感染,要引起重视,进行细胞学检测。本实验中<21岁年龄组中未发现宫颈癌患者,此与NCCN指南上指出的21岁以下女性无需行宫颈癌筛查的情况相符。(3)在本研究中发现宫颈癌组多重感染均为高危型HPV混合感染,其多重感染率明显高于对照组。可以认为HPV多重感染与宫颈病变密切相关,随着宫颈病变程度加重,HPV多重感染机会增加。因此,多重感染增加了宫颈癌发生的风险。第二部分HPV16 E6/E7变异与宫颈癌的相关性研究[目的]分析HPV16主要的致癌基因E6、E7的变异特征,探讨与宫颈癌发生发展相关的HPV16型E6和E7的突变位点。[方法]收集2013年9月至2015年12月在昆明医科大学第三附属医院妇科住院接受治疗的HPV16阳性的宫颈癌女性患者的组织标本194例,并选择同期到我院门诊体检的HPV16阳性但无宫颈病变妇女的宫颈分泌物标本197例为感染组。所有标本采集和诊治过程均经患者知情同意,宫颈病变以病理学诊断为金标准。提取标本的DNA,进行HPV分型,分型后HPV16阳性的样品进行PCR扩增E6和E7完整基因片段,获得E6和E7完整基因片段后进行碱基测序,寻找HPV16E6和E7的变异特征,并将常见的突变位点结合临床资料进行分层分析。[结果](1)对HPV16E6、E7测序产物进行系统进化分析结果显示只有亚洲变异型和欧洲变异型,没有发现非洲1型、非洲2型、亚-美型和北美变异型,且统计分析显示变异型在感染组及宫颈癌组无统计学意义(P>0.05)。(2)在所有HPV16阳性样本中,HPV感染但无宫颈病变组和宫颈癌组E6突变频率分别为70.00%(126/180)和73.18%(131/179),HPV16 E6基因在感染组和宫颈癌组中最常见的突变为：T178G/A (D25E),A276G(N58S),T350G(L83V),统计分析显示这些突变在感染组及癌症组中分布差异无统计学意义。(3)E7基因常见的突变有C627T、G666A、T843C、T846C、A647G(N29S)、C749T(S63F),其中C749T(S63F)变异在癌症患者与感染者之间的差异有显著性(P<0.01)。[结论](1)本实验中E6、E7系统进化分析只发现亚洲变异型和欧洲变异型,且变异型与宫颈癌发生发展无明确相关。(2)HPV16 E6基因在感染组和宫颈癌组中最常见的突变为：T178G/A (D25E),A276G(N58S),T350G(L83V),且这些突变在感染组及癌症组中分布无差异性。(3)HPV16型E7基因中C749T(S63F)突变在宫颈癌组与感染组之间的差异显著,C749T(S63F)突变可能与宫颈癌的发生存在相关性,此变异与宫颈病变进展相关的机制需做进一步研究。其余E7基因变异未发现与宫颈病变进展存在相关性。本研究中许多HPV16 E6、E7变异与宫颈癌的相关性与以往报道不一致,可能因为宫颈癌的发生是多因素、多基因共同作用的结果,除HPV病毒感染外,宿主的基因变异也起到重要作用,因此我们将继续对宿主p53及pRb基因多态性进行研究,之后再综合E6、E7变异及p53、pRb基因多态性的结果进行下一步分析。