脓毒症心功能障碍（sepsis-induced myocardial dysfunction,SIMD）是脓毒症引起的可逆的、以心脏收缩功能障碍为主的心功能不全,伴或不伴有舒张功能障碍。脓毒症可引起多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）,SIMD是MODS的心脏表现,与患者病死率密切相关。目前SIMD的具体病生理机制仍不清楚,可能的机制包括炎症因子对心肌的抑制、细胞凋亡、线粒体功能障碍、钙离子转运障碍等,而炎症反应失控是最重要的机制之一。革兰氏阴性杆菌释放的内毒素脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是启动脓毒症炎症和免疫失衡的主要物质之一。有学者研究显示,在脓毒症时也存在心肌冬眠机制,心功能障碍可能是机体的自我保护,提示体内存在内源性保护机制。Apelin是血管紧张素样G蛋白耦联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）APJ的内源性配体。研究表明,apelin/APJ系统在中枢和外周均有广泛分布,在调节心肌收缩和血管张力及调节炎症、免疫、能量代谢、水平衡等多方面发挥作用。Apelin有多种亚型,如apelin-36、apelin-28、apelin-17、apelin-13等。Apelin-13在体内可以转化为更稳定的焦谷氨酸形式-[Pyr1]apelin-13,研究表明apelin-13和[Pyr1]apelin-13是apelin在心血管系统中最主要的亚型。Apelin-13具有很强的生物活性,尤其在心血管功能调节中发挥重要作用。虽已有研究显示apelin能增强心肌收缩力,减轻心脏前后负荷,且具有抗炎作用,但apelin/APJ系统对LPS诱导的心功能障碍是否有保护作用尚不明确。本研究利用C57BL/6小鼠腹腔注射LPS构建内毒素诱导的脓毒症心功能障碍模型,并通过给予模型小鼠apelin-13及其抑制剂[Ala]-apelin--13（F13A）干预,探讨apelin对SIMD的保护作用及其作用机制。本研究共分五部分。第一部分SIMD小鼠模型的构建及模型小鼠心肌组织apelin表达变化目的:成功构建LPS诱导的小鼠SIMD模型,探讨心肌apelin水平与SIMD的关系。方法:给予C57BL/6小鼠腹腔注射LPS 20mg/kg制作SIMD模型,对照组（Control组）给予同等体积的生理盐水,并分别于造模8小时（LPS8h组）和24小时（LPS24h组）进行心脏超声检查,并留取组织及血清标本。用HE染色观察心肌病理变化,透射电镜观察心肌超微结构改变。用ELISA方法检测血浆及心肌匀浆中炎症因子TNF-α、IL-6的变化。用Q-RT PCR及Western blot检测心肌apelin m RNA及蛋白表达变化。结果:1.与Control组相比,LPS8h组和LPS24h组小鼠左室收缩功能指标LVEF、LVFS、SV均明显降低。2.与Control组相比,LPS8h组和LPS24h组小鼠心肌组织出现毛细血管轻微扩张、肌间红细胞渗出、粒细胞边缘聚集,LPS24h组病变较LPS8h组更明显。3.与Control组相比,LPS 8h组血浆及心肌组织匀浆TNF-α、IL-6含量显著升高,LPS 24h组出现明显回落,但仍高于Control组。4.与Control组相比,LPS8h组心肌apelin m RNA及蛋白表达均明显减低,LPS24h组apelin m RNA水平明显降低,但apelin蛋白表达无明显变化。小结:LPS诱导小鼠出现心脏收缩功能下降,伴有炎症因子显著升高,病理改变较轻微;Apelin在SIMD模型小鼠心肌组织中表达下调,提示其可能参与SIMD的发生。第二部分Apelin-13预处理对脂多糖诱导的心功能障碍的影响目的:探讨内源性apelin/APJ系统对SIMD的干预作用。方法:C57BL/6小鼠分为2个亚组,第一亚组分4组:control组、LPS组、apelin+NS组、apelin+LPS组;第二亚组分3组:LPS组、apelin+LPS组、F13A+LPS组。LPS组:LPS（20mg/kg）腹腔注射造模同前;apelin+LPS组、apelin+NS组和F13A+LPS组:在腹腔注射LPS或NS前1小时接受apelin-13（1mg/kg）或F13A以（1mg/kg）腹腔注射预处理。LPS或NS注射后24小时行心脏超声检查及标本取材。第一亚组观察apelin-13预处理对LPS干预小鼠心脏超声的影响。第二亚组ELISA方法测定apelin-13和F13A预处理对模型小鼠血浆及心肌组织匀浆中TNFα、IL-6水平的影响。结果:1.与LPS组比较,apelin+LPS组LVEF和SV显著增加;2.与LPS组比较,apelin+LPS组血清IL-6水平显著降低,血清TNFα及心肌组织IL-6、TNFα水平有降低趋势,但无统计学差异;3.与control组比较,apelin-13预处理引起正常小鼠LVEF的下降,但对CO无显著影响;4.与LPS组比较,F13A+LPS组炎症因子水平无显著差异。小结:Apelin预处理对LPS诱导SIMD小鼠心功能有显著改善,显著降低炎症因子水平,对SIMD有保护作用;本研究条件下F13A对内源性apelin无明显拮抗作用。第三部分外源性apelin-13干预对脂多糖诱导的心功能障碍的保护作用目的:探讨外源性给予apelin-13对LPS诱导的SIMD的影响。方法:C57BL/6小鼠分为4组,LPS组、LPS+apelin-L组、LPS+apelin-H组、LPS+apelin+F13A组。LPS组:造模同前;LPS+apelin-L组、LPS+apelin-H组和LPS+apelin+F13A组:LPS 20mg/kg腹腔注射后1小时分别接受apelin-13小剂量（100ug/kg）,或apelin-13大剂量（500ug/kg）,或apelin-13大剂量联合F13A 500ug/kg腹腔注射,之后每5小时1次,共4次。LPS或NS注射后24小时行心脏超声检查及标本取材。用HE染色观察心肌病理变化,透射电镜观察心肌超微结构改变。用ELISA方法检测血浆及心肌匀浆中炎症因子TNF-α、IL-6的变化。观察apelin-13和F13A干预对炎症因子、心肌形态学的影响,并观察apelin-13大剂量对模型小鼠心脏功能的影响。结果:1.与LPS组比较,apelin-13大剂量干预组LVEF及SV明显升高;2.Apelin-13干预明显抑制了LPS所致IL-6升高,以大剂量更显著;3.与apelin-13大剂量组比较,联合F13A组炎症因子水平显著升高。小结:Apelin-13干预明显改善了LPS诱导的心功能障碍,显著降低炎症因子水平;F13A部分拮抗了apelin-13对炎症因子的作用。第四部分Apelin-13对脂多糖诱导的心功能障碍保护作用的机制研究目的:探讨apelin-13对LPS诱导的SIMD的保护作用机制。方法:C57BL/6小鼠分为5组:control组、LPS组、apelin+LPS组、LPS+apelin-H组、LPS+apelin+F13A组。TUNEL法检测心肌组织的凋亡细胞,用Q-RT PCR检测心肌caspase-3m RNA表达,Western blot检测心肌caspase-3、caspase-8、LC3Ⅱ、beclin1、TLR4、ERK、NF-κB等的蛋白表达。结果:1.LPS干预后心肌细胞凋亡增加,apelin-13干预明显减少心肌凋亡细胞比率,降低cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-8表达,同时予以F13A则拮抗了apelin-13的这一作用。2.与Control组比较,LPS组LC3Ⅱ及beclin1蛋白表达增加;apelin-13干预后两者表达进一步升高,同时予以F13A则明显抑制了这一趋势。3.Apelin干预明显抑制LPS注射引起的心肌组织TLR4蛋白表达增加及ERK、NF-kappa Bp65的磷酸化水平升高,同时予以F13A则拮抗了apelin-13的这一作用。小结:Apelin-13可能通过TLR4/ERK/NF-κB信号通路抑制炎症反应及细胞凋亡对LPS诱导的心功能障碍起保护作用。第五部分Apelin-13对脂多糖所致肺损伤的保护作用目的:探讨apelin-13对LPS所致肺损伤的干预作用方法:C57BL/6小鼠分为6组:control组、LPS 8h组、LPS 24h组、apelin+LPS组、LPS+apelin-H组、LPS+apelin+F13A组,LPS注射造模同前。用HE染色观察肺组织病理变化,透射电镜观察肺组织超微结构改变。TUNEL法检测细胞凋亡。用ELISA方法检测肺组织匀浆中炎症因子TNFα、IL-6水平变化。结果:1.与control组比较,LPS组出现明显的肺间质水肿,炎性细胞浸润,LPS 24h组较LPS 8h组病变更明显,apelin-13干预明显减轻了LPS所致的病理改变,联合F13A干预组病变加重。2.与control组比较,LPS 8h组肺组织匀浆中TNF-α、IL-6含量明显升高,LPS 24h组出现明显回落,但仍高于对照组;与LPS 24h组相比,apelin+LPS组及LPS+apelin-H组炎症因子水平均呈下降趋势,联合F13A干预部分拮抗了apelin-13的这一作用。3.与control组比较,LPS组凋亡细胞明显增多,apelin-13干预明显减少了凋亡细胞比率。小结:Apelin-13干预明显减轻LPS所致的肺病理改变,降低炎症因子水平,减少肺组织细胞凋亡。Apelin-13对LPS所致的肺损伤有保护作用。