为缓解水资源短缺的状况，世界上许多国家利用工业废水和生活污水进行农田灌溉。美国、德国和日本等发达国家，很早就意识到污水回用的重大意义，将城市污水再生处理后，用于农业灌溉、地下水回灌、景观生态用水、工业用水、绿化灌溉和其他用水。美国针对不同的回用对象，制定了严格的回用标准。美国城市污水处理等级基本都在二级以上，处理率可以达到100%。目前，发达国家污水灌溉主要用于园林、牧草以及饲料作物，也用于某些经济作物，而很少应用于粮食作物以及蔬菜。在我国一方面水资源紧缺，另一方面废水的排放量逐年增加。为缓解水资源紧缺的现状，我国大规模地利用污水进行农田灌溉。城市污水集中处理后进行农田灌溉，可以节约大量的水资源，提高水的再利用率，缓解供水压力；可以充分利用其中的氮、磷资源，减少化肥的使用量。然而我国城镇污水处理率不高，处理水平低。国内外研究证实，污水中含有多种外来化学物，如铅（Pb）、铬（Cr）、镉（Cd）等金属以及多氯联苯、邻苯二甲酸酯类、多环芳烃类、杂环类化合物等有机污染物。利用含有金属和有机污染物的污水进行农田灌溉，可能导致一些地区土壤中金属和有机污染物蓄积，且有逐年加重的趋势，致使土壤生产力下降，农作物生长不良而造成减产，甚至颗粒无收。同时，由于这些化学污染物大多具有生物半减期长、脂溶性、难以降解、易于生物富集等特性，可以通过食物链逐级放大后进入到人体内，从而对人体健康产生潜在的危害。人体摄入被金属污染的饮用水或食物后，体内必需微量元素就会被消耗，从而带来一系列的健康问题，如免疫功能缺陷、宫内发育迟缓、营养缺乏相关的残疾以及肿瘤的高发等。河北省石家庄市是我国主要污灌区之一，主要为市区以南的几个县的部分地区，总面积约438.8km2。我教研室曾先后两次对石家庄污灌区进行人口死因回顾性调查研究。20世纪80年代调查结果发现全死因标化死亡率污灌区为623.71/10万，显著高于净灌区的557.22/10万；恶性肿瘤标化死亡率，污灌区为155.45/10万，显著高于净灌区144.57/10万，并且有逐年上升的趋势，由1977年的145.79/10万上升到1982年的200.59/10万。本教研室2008年再一次对污灌区进行了死因回顾性调查，结果发现污灌区的全死因标化死亡率为525.78/10万，显著高于净灌区的453.14/10万；污灌区男性、女性恶性肿瘤标化死亡率均显著高于净灌区。两次调查结果表明污水灌溉可能是污灌区居民恶性肿瘤死亡率高于净灌区和全国平均水平的一个重要影响因素，提示灌溉用污水可能有潜在致癌能力。基于人群流行病学调查结果，很有必要对灌溉用污水的潜在致癌能力进行进一步研究，从而规范污水灌溉的管理，达到保护环境、预防疾病、促进健康的目的。第一部分石家庄灌溉用污水中金属和有机污染物的分析目的：了解石家庄灌溉用污水中的主要成分。方法：用电感耦合等离子体质谱方法（ICP-MS）测定石家庄市灌溉用污水中金属的含量；采用固相萃取的方法，提取水样中的有机污染物，用气相色谱质谱联机（GC-MS）定性分析其中的有机污染物。结果： ICP-MS测定农田灌溉用污水中金属元素铬（Cr）、锰（Mn）、镍（Ni）、铍（Be）、砷（As）、镉（Cd）、铅（Pb）的含量，应用在线加入内标的方法来校正干扰效应，加标回收率为96%~102.3%，相对标准偏差(RSD)小于3%，表明该方法的准确性和精密度良好。所测水样中各金属Mn、Ni、Be、As、Cd含量均符合城市污水再生利用农田灌溉用水水质标准（GB20922-2007）；上游和中游的样本Cr浓度超过国家标准，分别超过标准2.3和0.1倍；上游和下游的样本Pb的浓度超过国家标准，分别超过标准的0.83和0.55倍。不同地点的混合样本中Cr和Pb的浓度分别超过国家标准0.78和0.43倍。GC-MS共检出86个峰，选择可信度大于70%的峰，共检出30种有机化学物，主要有邻苯二甲酸酯类、杂环类化合物、多环芳烃类化合物、苯胺类化合物等。结论：石家庄灌溉用污水中Cr和Pb浓度超过国家标准；GC-MS共检出30种有机污染物，其中很多有机污染物是确认的人类致癌物或可疑致癌物。第二部分石家庄灌溉用污水短期致癌作用研究目的：应用配套短期致癌试验对石家庄市灌溉用污水的短期致癌效应进行评价。方法：选择反映不同遗传学终点的短期致癌试验。鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames）：选用平板掺入法。37℃预培养后，将含有0.5mM组氨酸-生物素的顶层琼脂培养基分装于试管中，然后每管依次加入增菌液0.1ml，不同浓度的受试物0.1ml（需代谢活化时，还需要另外加入S9混合液0.5ml），混合均匀，迅速铺板。顶层琼脂凝固后，翻转平皿，37℃恒温箱内培养48h。受试物设四个剂量组，分别为25μl，50μl，75μl、100μl浓度的灌溉用污水样品。同时设溶剂对照（蒸馏水）、阳性对照以及未处理对照。每个剂量设3个平行皿，重复2次。受试物平皿的实际回变菌落数是自发回变的菌落数2倍及以上，并且有剂量-反应关系就可以认为该受试物诱变试验阳性。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：昆明小鼠按体重随机分成5组，每组10只，雌雄各半。三个不同浓度的剂量组分别含25%、50%、100%的灌溉用污水，自由饮用。蒸馏水为阴性对照，阳性对照组采用环磷酰胺（40mg/kg腹腔注射）。选择两个点进行取材，一个时间点是连续两天暴露于受试物后取材；第二个时间点是亚急性连续15天暴露于受试物后取材。颈椎脱臼法处死小鼠后，取胸骨，涂片，自然干燥，甲醇固定后10%Giemsa染液染色10min，油镜镜检。采用盲法进行计数分析。试验组和阴性对照组相比，微核率差别有统计学意义并有剂量反应关系，即可判定为阳性结果。单细胞凝胶电泳试验：昆明小鼠按体重随机分成5组，每组8只，雌雄各半。三个不同浓度的剂量组分别含25%、50%、100%灌溉用污水，自由饮用。蒸馏水为阴性对照，选用已知的能引起DNA损伤的苯巴比妥钠为阳性对照（140mg/kg腹腔注射）。处死小鼠，制备肝细胞悬液，细胞密度为104～105个/ml。按常规彗星试验三明治法制片。将载玻片置于新配置的预冷裂解液中，低温避光裂解1h，于电泳液避光解旋30min，室温避光电泳30min （电压25V，电流300mA）；电泳结束后取出载玻片用甲醇固定10min。用Milli-Q纯水漂洗3次，每次3min；3.2%的AgNO3染色30min，4℃预冷的显色液显色5min，甲醇脱色5min。每只动物计数100个细胞。普通光学显微镜下观察，CASP彗星分析软件分析Olive尾矩。结果：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验：不加S9体外代谢活化系统，不同浓度的灌溉用污水引起的TA98回变菌落数均大于未处理对照组的两倍，并有剂量反应（y=34.833+113.133x，rs=0.976，P=0.000）；加S9体外代谢活化系统，不同浓度的灌溉用污水引起的TA98回变菌落数均大于未处理对照组的两倍，并有剂量反应（y=42.833+124.133x，rs=0.954，P=0.000）。说明灌溉用污水具有致突变作用，内含有直接和间接性移码型的致突变物。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：连续两天暴露于灌溉用污水，各组小鼠骨髓细胞微核率有显著性差异（F=171.746，P=0.000），阳性对照组小鼠骨髓细胞微核率与阴性对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）；但不同剂量的污水处理组和阴性对照组相比，小鼠骨髓细胞微核率差别无统计学意义（P>0.05）。连续15天染毒后，随着染毒时间的延长，各组小鼠骨髓细胞微核率差别有统计学意义（F=71.706，P=0.000）；其中25%污水处理组小鼠骨髓细胞微核率和阴性对照组相比差别无统计学意义（P>0.05），50%和100%污水处理组小鼠骨髓细胞微核率和阴性对照组相比显著增加（P<0.01）；随着污水暴露浓度的增加，微核率显著增加（y=0.003+0.007x，rs=0.814，P=0.000）。单细胞凝胶电泳试验：小鼠连续15天暴露于灌溉用污水，各组Olive尾矩数值显著升高(=35.815，P=0.000)；25%污水处理组Olive尾矩和阴性对照组相比差别无统计学意义（P>0.05），50%和100%污水处理组Olive尾矩和阴性对照组相比差别有统计学意义（P<0.01）；随着污水暴露剂量的增加，Olive尾矩显著增加（y=0.298+4.055x，rs=0.905，P=0.000）。结论：1Ames试验结果表明，石家庄灌溉用污水里面含有直接或间接地可以引起移码型突变的污染物。2小鼠骨髓细胞微核试验的结果表明，石家庄灌溉用污水可能在小鼠体内发生了物质蓄积，并能引起染色体损伤。3小鼠体内肝细胞彗星试验的结果表明，石家庄灌溉用污水可以引起小鼠肝细胞DNA链断裂，从而造成DNA损伤。第三部分灌溉用污水对实验性大鼠肝癌的促进作用目的：在短期致癌试验阳性结果的基础上，采用大鼠肝转变灶诱发试验对石家庄灌溉用污水的致癌作用进行进一步的研究。方法：健康清洁级5周龄雄性SD大鼠，按体重随机分为5组，饲养于河北医科大学第四附属医院实验动物中心。大鼠适应一周后，按Ito模式构建大鼠两阶段肝癌促进模型， A组用生理盐水作为启动剂，B、C、D、E组根据动物体重给大鼠一次性腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN）200mg/kg作为启动剂。经过为期两周的恢复期饲养后，B、C、D、E组大鼠给予不同浓度的污水样品（0%，25%，50%，100%）作为促进剂，暴露方式为自由饮用，A组大鼠自由饮用蒸馏水。第3周末按经典方法进行2/3肝大部分切除术，恢复两天后再暴露于不同浓度的污水，每周记录一次动物体重、饮水及饲料消耗情况。第8周末实验结束时，称重后将其断头处死，同时采集血样进行生化分析。小心分离肝脏并称重。一部分肝脏标本直接用多聚甲醛固定，一部分用液氮冷冻后保存于-80℃冰箱中待用。根据南京建成试剂盒说明书测定大鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）和γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）的浓度；HE染色病理切片观察染毒大鼠肝组织病变；RT-PCR检测大鼠肝组织GST-Pi mRNA的表达；免疫组化及Western blot检测大鼠肝组织GST-Pi蛋白的表达。结果：1大体观察和脏器系数变化：在实验结束的第8周，各组动物体重差别有统计学意义（F=27.925，P=0.000），阴性对照组和25%污水处理组与DEN对照组相比动物体重无显著差异（P＞0.05），50%和100%污水处理组动物体重和DEN对照组相比显著降低（P<0.01）；随着污水暴露剂量的增加，大鼠体重显著下降（y=414.146-53.136x，rs=-0.822，P=0.000）。不同浓度污水处理组大鼠肝脏脏器系数有显著性差异（F=6.961，P=0.000），其中阴性对照组和25%污水处理组与DEN对照组相比大鼠肝脏脏器系数无显著差异（P＞0.05），50%和100%污水暴露组大鼠肝脏脏器系数显著高于DEN对照组（P<0.05），随着污水暴露剂量的增加，大鼠肝脏脏器系数显著增加（y=2.935+0.359x，rs=0.459，P=0.004），表明灌溉用污水具有促进大鼠肝细胞增殖的作用。各组大鼠摄食量和饮水量差别均无统计学意义（P>0.05）。2肝脏大体及病理形态学观察：HE染色高倍镜下25%灌溉用污水暴露组大鼠肝脏汇管区可见少量增生的卵圆细胞；50%剂量组的大鼠肝小叶组织结构破坏，可见肝细胞再生性结节和小细胞增生灶；在100%剂量组，大鼠肝小叶组织结构破坏更为严重，有纤维组织增生和假小叶形成，汇管区可见大量卵圆细胞增生。3灌溉用污水对肝功能的影响：各组大鼠的血清中AST浓度有显著性差异（=35.735，P=0.000）；阴性对照组和25%污水处理组的大鼠血清AST浓度与DEN对照组相比差别无统计学意义（P>0.05）；50%和100%污水处理组大鼠血清中AST浓度也显著高于DEN对照组（P<0.01）；随着污水暴露剂量的增加，AST浓度也显著增加（y=57.620+248.277x，rs=0.928，P=0.000）。各组大鼠血清ALT浓度差别有统计学意义（=38.684，P=0.000），阴性对照组与DEN对照组相比大鼠血清ALT浓度无显著性差异（P>0.05），而各污水处理组的大鼠血清ALT浓度显著高于DEN对照组（P<0.01）；随着染毒剂量的增加，ALT浓度也显著增加（y=14.540+246.921x，rs=0.960，P=0.000）。各组大鼠血清γ-GT浓度差别有统计学意义（F=12.987，P=0.000），其中阴性对照组、25%和50%污水处理组的大鼠血清γ-GT浓度与DEN对照组比较，差别无统计学意义（P>0.05），100%污水处理组的大鼠血清中γ-GT浓度与DEN对照组比较，差别有统计学意义（P<0.01）。各剂量组的大鼠血清AKP浓度未观察到显著差异（F=1.824，P=0.144）。4肝组织中GST-Pi mRNA的表达：在DEN启动作用下，给予大鼠暴露不同浓度的污水后，各组大鼠肝脏GST-Pi mRNA表达量差别有统计学意义（F=37.904，P=0.000）。阴性对照组和25%污水处理组，大鼠肝脏GST-Pi mRNA表达量与DEN对照组相比差别无统计学意义（P>0.05）；大鼠暴露50%和100%的灌溉用污水后，诱导大鼠肝脏GST-PimRNA表达量与DEN对照组相比均显著增加（P<0.01）；随着污水暴露剂量的升高，诱导GST-Pi mRNA表达量显著增加，在100%污水处理组表达量最高（y=1.029+1.060x，rs=0.950，P=0.000）。5肝组织中GST-Pi蛋白的表达：GST-Pi蛋白在阴性对照组和DEN对照组的大鼠肝组织中仅有少量表达。在DEN启动作用下，给予大鼠暴露不同浓度的污水后，诱导GST-Pi蛋白表达量各组之间差别有统计学意义（F=268.176，P=0.000），其中阴性对照组和DEN对照组相比大鼠肝脏GST-Pi蛋白表达量无显著性差异（P>0.05），而不同浓度的污水处理组与DEN对照组相比大鼠肝脏GST-Pi蛋白表达量显著增加（P<0.01），随着污水暴露浓度的增加，GST-Pi蛋白表达量显著增加（y=0.470+0.823x，rs=0.972，P=0.000）。免疫组织化学的方法在阴性对照组未观察到GST-Pi蛋白的表达。在DEN启动作用下，DEN对照组的大鼠肝组织中仅有少量表达。在DEN启动作用下，给予大鼠暴露不同浓度的污水后，诱导GST-Pi蛋白表达量与DEN对照组相比均明显增加，在100%污水处理组表达量最高，污水暴露浓度与GST-Pi蛋白表达量之间呈明显的剂量效应关系。结论：石家庄灌溉用污水有促癌作用，能引起Ito模型大鼠体重显著下降，肝脏脏器系数显著升高，并能引起肝功能异常，诱导肝组织中GST-Pi在mRNA水平和蛋白表达升高。第四部分CYP1A1和CYP1B1在灌溉用污水促癌实验中的作用目的：研究细胞色素CYP1A1和CYP1B1在灌溉用污水促癌试验中的作用方法：动物模型同第三部分。用RT-PCR和Western blot方法观察CYP1A1和CYP1B1在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果：1灌溉用污水对大鼠肝脏CYP1A1mRNA及蛋白表达的影响：各组大鼠肝脏CYP1A1mRNA表达有显著性差异（F=73.054，P=0.000）；阴性对照组的大鼠肝脏CYP1A1mRNA表达和DEN对照组相比差别无统计学意义（P>0.05），但不同浓度的污水暴露组的大鼠肝脏CYP1A1mRNA表达和DEN对照组相比显著增加（P<0.01）；随着污水暴露剂量的增加，其表达量显著增加（y=0.346+0.621x，rs=0.941，P=0.000）。各组CYP1A1蛋白的表达量差别有统计学意义（F=6.788，P=0.007）；阴性对照组和25%污水暴露组的大鼠肝脏CYP1A1蛋白表达量和DEN对照组相比差别无统计学意义（P>0.05），50%和100%污水暴露组的大鼠肝脏CYP1A1蛋白表达量和DEN对照组相比显著增高（P<0.05），随着污水暴露剂量的增加，其表达量显著增加（y=0.557+0.316x，rs=0.799，P=0.001）。2灌溉用污水对大鼠CYP1B1mRNA及蛋白表达的影响：各组大鼠肝脏CYP1B1mRNA表达差别有统计学意义（F=11.539，P=0.001）；其中阴性对照组的大鼠肝脏CYP1B1mRNA表达和DEN对照组相比差别无统计学意义（P>0.05），但不同浓度的污水暴露组大鼠肝脏CYP1B1mRNA表达量和DEN对照组相比显著增加（P<0.05）；随着污水暴露剂量的增加，CYP1B1mRNA表达量显著增加（y=0.527+0.313x，rs=0.907，P=0.000）。各组大鼠CYP1B1蛋白表达有显著性差异（F=8.247，P=0.003）；其中阴性对照组的大鼠肝脏CYP1B1蛋白表达水平和DEN对照组相比差别无统计学意义（P>0.05），但不同浓度的污水暴露组大鼠肝脏CYP1B1蛋白表达水平和DEN对照组相比显著增加（P<0.05）；随着污水暴露剂量的增加， CYP1B1蛋白表达量显著增加（y=0.530+0.528x，rs=0.789，P=0.002）。结论：石家庄市灌溉用污水可以诱导细胞色素P4501A1和P4501B1的异常表达，发挥促癌剂的作用，最终导致大鼠肝脏发生癌前病变。