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原发性肝细胞癌(HCC)是世界严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一,其发病率高居第五位,是第三位致死性恶性肿瘤。具有起病隐匿,侵袭性强,生长迅速,治疗后易复发等特点。中国是肝癌发病率与死亡率最高的国家,肝癌的发病人数占全球的55％。尽管近年随着人们对健康的关注和诊疗水平的不断提高,肝癌的临床疗效研究和分子基础研究都取得了不少进展,但由于肝癌发生发展和转移的特殊性,目前仍缺乏有效的肝癌早期预防和筛查手段。目前肝癌治疗方法以早期手术切除为主,同时辅以介入治疗、消融治疗及生物化学药物治疗等,但都具有疗效不确定、治疗后易复发等缺点,这与肝癌发生发展的分子生物学机制未明有关。因此,发现并深入研究影响肝癌恶性生物学行为的新基因,有助于准确揭示肝癌发生发展的分子机制,为肝癌的早期诊断提供新的思路及基因治疗靶点,对进一步提高肝癌的诊治水平及改善预后有着非常重要的现实意义。过去十几年的研究主要集中在对肝癌发生进展中发挥关键作用的基因和蛋白上,近年来大量研究开始转向与肝癌发生进展相关的具有新的调控作用的微小RNA分子(miRNA)上。 miRNA是一种广泛存在于真核生物中、由19～23个核苷酸构成的内源性高度保守、单链非编码RNA小分子。miRNA大约占人类总基因的1%～3%,却调节着大约30%的蛋白编码基因。miRNA不编码蛋白,而是通过完全或不完全碱基配对的方式与靶RNA的3’端的非编码区(3’UntranslationRegion3’UTR)结合,在转录后水平调控mRNA翻译,从而参与对靶基因功能的调节,并进而影响细胞生长发育、增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。越来越多的研究发现,在肿瘤组织与其癌旁组织存在miRNA表达谱差异,且半数以上的miRNA定位于和肿瘤相关的染色体区域及脆性位点,提示miRNA在肿瘤发生发展过程中起着重要作用。 近年研究表明:在肝癌细胞中亦普遍存在miRNA的表达异常,它们扮演着“癌基因”或“抑癌基因”的角色。大量研究证据还表明miRNA在肝癌的进展中发挥着重要作用,并且直接参与了肝癌细胞的分化、凋亡、侵袭和远处转移的过程,研究还证实miRNA表达谱还与肝癌病理类型、恶性程度、分期、分级等临床病理特征密切相关,但miRNA在肝癌中的具体作用及其机制还未完全阐明,因此探讨在肝癌发生发展中起着重要作用的miRNA及其作用机制,对有效防治肝癌具有十分重要的意义。 本课题在既往利用miRNA基因芯片技术对肝癌癌组织与其癌旁组织之间进行miRNA表达谱差异分析研究基础上,筛选获得一组差异表达上调的miRNA分子,提示该组miRNA分子可能在肝癌的发生发展产生一定作用。我们进一步选取了在肝细胞癌中表达上调明显的miRNA分子miR-221,对其在肝癌细胞株中表达差异及其对肝癌细胞生物学行为影响进行分析。本课题旨在从miR-221对肝癌细胞的生物学行为影响中,初步了解miR-221在肝细胞癌转移中的作用,为全面了解miR-221在肝细胞癌发生发展、转移中联系以及分子机制提供实验研究基础,指导药物分子靶向性治疗研究的新方向。 第一部分miR-221在各肝癌细胞系中的表达及最适实验细胞的选择 目的： 观察miR-221在各肝癌细胞系中的表达,探讨其中最适合进行细胞生物学功能实验的肝癌细胞系。 方法： 收集常用于实验的正常肝细胞系(LO2)和肝癌细胞系(Huh7、PLC、LM3、SMMC-7721、MHCC-97H)。运用Realtime-PCR检测miR-221在正常肝细胞系及各肝癌细胞系的表达量。 结果： Realtime-PCR在正常肝细胞系及各肝癌细胞系中miR-221检测显示:miR-221的表达在其他肝癌细胞系(Huh7、PLC、LM3、SMMC-7721、MHCC-97H)均比正常肝细胞系(LO2)明显上调(P<0.05)。其中以MHCC-97H表达上调最为明显(P<0.01)。 结论： 1、肝癌细胞系与正常肝细胞系之间存在miRNA差异表达。 2、miR-221在肝癌细胞系中的表达水平明显高于正常肝细胞系,miR-221在肝癌中可能是一种促癌基因。 第二部分miR-221shRNA干扰质粒构建、鉴定及其稳定转染肝癌细胞株的筛选 目的： 通过miR-221的反义基因shRNA干扰质粒构建和鉴定,为下调肝癌细胞中miR-221的表达提供实验工具,为进一步了解miR-221在肝癌中的功能提供实验依据。 方法： 构建pGenesil-AS-miR-221-shRNA干扰质粒及空载质粒,将上述质粒分别转染肝癌细胞株MHCC-97H并用G418筛选各质粒稳定转染细胞株。采用Realtime-PCR检测上述质粒对miR-221表达的影响。 结果： 1、通过菌液PCR、质粒酶切及测序鉴定,成功构建了pGenesil-AS-miR-221-shRNA干扰质粒的真核表达载体及空载质粒。 2、实时定量PCR证明转染该真核表达载体后的MHCC-97H细胞株,相对于空载体转染组和空白MHCC-97H细胞组中miR-221表达水平明显下调(P<0.05)。 结论： 成功构建了pGenesil-AS-miR-221-shRNA干扰质粒可显著下调肝癌细胞株MHCC-97H中miR-221的表达。 第三部分miR-221反义基因shRNA干扰质粒对肝癌细胞生物学行为影响 目的： 通过所获得pGenesil-AS-miR-221-shRNA干扰质粒及空载质粒稳定转染细胞株和空白MHCC-97H细胞株,来研究下调miR-221的表达水平对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响。 方法： 1、采用CCK-8法检测下调miR-221的表达水平对肝癌细胞增殖活性的影响。 2、采用细胞划痕试验检测下调miR-221的表达水平对肝癌细胞迁移能力的影响。 3、采用Tanswell法检测下调miR-221的表达水平对肝癌细胞侵袭力的影响。 结果： 1、下调MHCC-97H细胞中miR-221的表达水平后,其细胞活力明显低于对照空载质粒转染组和空白MHCC-97H细胞组(P<0.05)。 2、MHCC-97H细胞转染pGenesil-AS-miR-221-shRNA干扰质粒组的迁移能力显著低于对照空载质粒转染组和空白MHCC-97H细胞组(P<0.05)。 3、Transwell结果显示,MHCC-97H细胞转染pGenesil-AS-miR-221-shRNA干扰质粒组下室的侵袭细胞数明显低于转染空载质粒组和空白MHCC-97H细胞组(P<0.05)。 结论： 下调miR-221的表达水平可抑制肝癌细胞增殖能力,迁移能力,侵袭能力(P<0.05)。 结论 1、miR-221在肝癌细胞系中的表达水平明显高于正常肝细胞系,miR-221在肝癌中可能是一种促癌基因。 2、成功构建了pGenesil-AS-miR-221-shRNA干扰质粒可显著下调肝癌细胞株MHCC-97H中miR-221的表达。 3、下调miR-221的表达水平可抑制肝癌细胞增殖能力,迁移能力,侵袭能力。 4、miR-221有望成为肝癌治疗的新靶点。