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研究背景与目的:牙周病治疗的最终目标是使因炎症破坏的牙周组织得到再生和重建,基于干细胞、支架材料、生长因子的组织工程技术为牙周组织再生提供了有效的思路和方法。虽然间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗在再生医学领域取得了一定的效果,但仍存在所需细胞量大、生存率低、致瘤和致畸等安全性问题,因此亟需新的方法以促进组织再生。越来越多的研究表明,干细胞的旁分泌功能,即干细胞移植后分泌的生长因子、细胞因子是干细胞促进组织再生的主要机制。相比于干细胞移植,间充质干细胞条件培养液(Conditioned medium from MSCs,MSCs-CM)使用更加方便安全,具有更好的临床转化前景。牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是来源于牙周膜的一种成体干细胞,被认为是牙周再生治疗中较理想的种子细胞。研究表明应用PDLSCs移植或者PDLSCs-CM均获得了一定程度的牙周组织再生。然而,体外获取PDLSCs需要有多个拔除牙齿的牙周膜,培养成功率较低,分离获得周期较长。因此,PDLSCs在牙周再生治疗中的广泛应用受到了很大限制。牙龈干细胞(Gingiva-derived mesenchymal stem cells,GMSCs)是从牙龈中分离出来的间充质干细胞,具有自我更新、多向分化潜能等间充质干细胞的特性,用于牙周组织再生,亦取得了一定效果。相比于牙周膜干细胞,GMSCs取材方便,易于培养,免疫调节功能更加优越,因此GMSCs在牙周再生方面有更好的临床应用前景。目前还未见有牙龈间充质干细胞条件培养液用于牙周组织再生的研究。因此,本研究的目的是利用大鼠下颌第一磨牙牙周骨缺损模型,研究GMSCs-CM对牙周缺损再生的效果,并且与PDLSCs-CM进行比较,为GMSCs-CM的应用提供理论依据。研究方法:浓缩CM的制备:取临床健康的人牙龈组织,组织块法培养并传代获得人牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts,GFs),有限稀释法克隆化分离培养获得GMSCs,PDLSCs是张春澍同学慷慨相赠。上述细胞在生长培养基MEM中生长至融合后,换用无血清MEM继续培养48小时,收集各组无细胞、无血清的条件培养液,超滤离心管浓缩100倍,BCA法测定各组蛋白质浓度。大鼠牙周缺损模型的建立及分组处理:外科方法建立大鼠左侧下颌第一磨牙颊侧牙周骨缺损模型,Bio-gide胶原膜负载各组条件培养液,移植至牙周缺损,严密缝合。共分为五组:对照组,仅放置胶原膜;无血清培养基组(MEM组),胶原膜负载不含血清的浓缩α-MEM;GFs-CM组,胶原膜负载牙龈成纤维细胞浓缩条件培养液;GMSC-CM组:胶原膜负载牙龈干细胞浓缩条件培养液;PDLSCs-CM组:胶原膜负载牙周膜干细胞浓缩条件培养液。标本处理及分析:分别于术后1周、2周、4周处死动物,取左侧下颌第一磨牙及牙周组织,脱钙,石蜡包埋,进行HE及Masson染色,组织学观察并测量,统计学分析各组牙周再生的情况。进行肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、-10 的免疫组化染色及分析,分析各组炎症因子表达情况。对各组标本进行骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、Runt有关转录因子-2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2),免疫组化染色,以分析成骨细胞分化情况。