脊髓损伤尤其是颈脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI),是一具有高发病率、高致残率、高死亡率特点的外科疾病。近百年来,随着影像学、解剖学及生物力学的迅速发展,外科手术治疗取得了重大的进展,约有50%临床早期手术治疗的患者,脊髓运动功能恢复较好。但仍有约50%的患者,脊髓运动功能只恢复ASIA 1级或无改善,且术后仍残留神经源性膀胱、神经痛等并发症,给患者和医疗带来了沉重的负担。因此,寻求药物疗法成为了目前的主要任务。从督论治是结合经络、脏腑、气血辨证,历经千年形成的中医辨证治疗方法。督脉与脊髓在解剖、生理、病理多方面存在密切联系已成共识。现代医家提出脊髓损伤,病位在督脉,督脉瘀阻证是其临床常见证候。对于脊髓损伤督脉瘀阻证的诊断标准,医家仅提出了宏观诊断标准,尚缺乏其微观诊断标准的报道。从治疗上来说,诸多研究探讨了补阳还五汤从督论治脊髓损伤的临床疗效和可能机制,结果表明补阳还五汤治疗脊髓损伤疗效确切,但有效的基础是否与caspase-12介导的内质网凋亡通路有关,目前尚未见报道。鉴于脊髓在人体的重要功能,中药机制和微观指标的研究只能通过动物实验进行,但目前尚缺乏上颈段脊髓损伤动物模型。因此,本研究试图采用球囊导管法构建不同程度督脉瘀阻型上颈脊髓损伤动物模型。在此模型基础上,给予补阳还五汤治疗,基于caspase-12介导的内质网相关的细胞凋亡信号通路,探究补阳还五汤从督论治上颈脊髓损伤的机制;并从脊髓组织和血浆内血小板活化因子含量变化的角度,探讨补阳还五汤从督论治脊髓损伤的病理依据。以期为传统中药复方从督论治脊髓损伤的临床应用提供新的实验依据。第一部分球囊导管法构建不同程度督脉瘀阻型上颈脊髓损伤动物模型的研究目的:建立符合督脉瘀阻型上颈脊髓损伤临床病理特点的、压迫时间和程度可控的、不干扰影像学检查的及死亡率较低的动物模型。方法:将30只3月龄雌性SPF级Wistar大鼠随机分成空白组、假手术组、轻度压迫组、中度压迫组、重度压迫组。除空白组外,各组大鼠经右侧寰枕间隙置入未充气球囊于C1后弓下、硬膜囊外,逐层缝合,将留在体外的导管以双圈的方式分别固定于大鼠头顶部及腰背部。术后24h轻度、中度、重度压迫组大鼠,分别以手推压力泵向球囊内注射生理盐水至球囊内压达100kpa、300kpa、500kpa,模拟不同程度脊髓损伤。球囊压迫1h后行颈椎MRI检查;1、3、12、24h进行BBB评分和改良Tarlov评分;持续压迫24h后,采集四诊信息;取脊髓组织进行HE染色、Tune1凋亡原位检测,在光学显微镜下观察上颈脊髓损伤的病理特点。结果:1)颈椎MRI检查:大鼠椎管侵占率:空白组(N/A)、假手术组(1.000±0.000%)、轻度压迫组(53.000±8.485)%、中度压迫组(57.500±4.950)%、重度压迫组(67.000±11.314)%;2)各组大鼠BBB评分比较:分组因素P<0.01,存在交互效应,即空白组和假手术组大鼠的行为学评分均高于各模型组;模型组轻度压迫至重度压迫,行为学评分依次降低;时间*分组的P>0.05,时间和分组无交互作用,时间因素不随分组的不同而不同;3)四诊信息采集:正常组和假手术组大鼠精神状态良好,喜动,唇色淡红,耳色淡,爪色淡红;各模型组大鼠精神萎靡,蜷缩,运动减少,步态不稳,唇色暗红,耳暗红,爪色青紫。随着压迫的加重,各组大鼠舌下脉络色泽由红润转为紫黑,舌下脉络显色由1/3舌体长度增至2/3舌体长;4)HE染色显示:空白组和假手术组未显示出血、水肿或坏死。从轻度到重度压迫,出血量逐渐增加,灰质内神经元萎缩逐渐加重甚至坏死,白质脱髓鞘和轴突空泡变性逐渐加重;5)TUNEL法凋亡染色显示:空白组、假手术组、轻度压迫组未见明显凋亡细胞;中度和重度压迫组细胞凋亡指数轻度上升,但两组细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:本项目组改良了既往球囊压迫型脊髓损伤动物模型的建立方法,成功复制了符合督脉瘀阻型上颈脊髓损伤临床病理特点的、压迫时间和程度可控的、不干扰影像学检查的、死亡率较低的动物模型。第二部分补阳还五汤对急性上颈脊髓损伤内质网应激相关因子影响的研究目的:本部分实验采用前期建立的督脉瘀阻型上颈脊髓损伤模型,给予补阳还五汤治疗,以甲基强的松龙为阳性对照组,检测脊髓组织中内质网应激相关蛋白Caspase-12、Caspase-9及Caspase-3的表达,观察补阳还五汤对脊髓运动功能的影响,初步探索补阳还五汤基于caspase-12介导的内质网相关的细胞凋亡信号通路,对脊髓运动功能的改善作用。方法:将3月龄雌性SPF级Wistar大鼠40只随机分成假手术组、模型组、甲强龙组、补阳还五汤组,造模方法同第一部分。造模后第1天,甲强龙组经尾静脉注射甲基强的松龙共24 h,首剂量为30 mg/kg,余以5.4mg/(kg·h)每4 h给药1次。补阳还五汤组持续灌胃至第14天。取材以Western Blot法检测损伤脊髓节段内caspase-12、caspase-9、caspase-3蛋白的表达;于治疗后1、3、7、14d进行BBB评分。结果:1)治疗第14d大鼠脊髓组织中caspase-12、caspase-9、caspase-3蛋白的表达:中药组与甲强龙组各蛋白表达明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01),而中药组与甲强龙组比较差异无统计学意义(P>0.05);2)各组大鼠BBB评分比较:治疗第1天,模型组、甲强龙组和中药组BBB评分明显低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.01),3组间比较差异无统计学意义(P>0.05);各组治疗后BBB评分随着时间(3d、7d、14d)的延长而上升;与模型组比较,中药组与甲强龙组明显高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01);而中药组与甲强龙组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:补阳还五汤通过下调caspase-12介导的,内质网应激相关蛋白Caspase-12、Caspase-9及Caspase-3的表达,以改善大鼠脊髓运动功能,为基于caspase-12介导的内质网相关的细胞凋亡治疗脊髓损伤提供了新的思路。第三部分补阳还五汤对督脉癖阻型上颈脊髓损伤大鼠血小板活化因子的影响目的:本部分实验采用前期建立的督脉瘀阻型上颈脊髓损伤模型,给予补阳还五汤治疗,以甲基强的松龙为阳性对照组,从大鼠脊髓组织和血浆内血小板活化因子含量变化的角度,探讨补阳还五汤从督论治脊髓损伤的病理依据。方法:分组、造模方法、干预措施同第二部分,6只/组。于治疗后第14天,应用ELISA法检测损伤脊髓节段内和血浆内血小板活化因子(PAF)的变化;于治疗后1、3、7、14d对所有大鼠进行BBB评分。结果:1)大鼠血浆PAF的表达结果:中药组和甲强龙组PAF表达均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01);中药组表达均低于甲强龙组,差异均有统计学意义(P<0.01);中药组、甲强龙组和假手术组各蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05);2)大鼠脊髓组织PAF的表达结果:中药组PAF表达均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01);甲强龙组PAF表达低于模型组,差异无统计学意义(P>0.05);中药组表达低于甲强龙组,差异无统计学意义(P>0.05);中药组、甲强龙组脊髓PAF高于假手术组,差异均有统计学意义(P<0.05);3)各组大鼠BBB评分比较:治疗后BBB评分随着时间(3d、7d、14d)的延长而上升;与模型组比较,中药组与甲强龙组大鼠BBB评分明显高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01),而中药组与甲强龙组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:补阳还五汤可通过下调脊髓组织和血浆内血小板活化因子的含量修复脊髓运动功能;并初步为脊髓损伤和督脉瘀阻的密切相关、补阳还五汤从督论治脊髓损伤提供了病理依据。