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应用RNAi技术,在离体条件下沉默cbfal基因,然后检测其对鹿茸干细胞成骨分化的影响。本试验将填补cbfal调控鹿茸骨化机制的研究空白；为骨化和骨质疏松等领域的研究提供指导和理想的研究模型；为提高鹿茸品质开拓新的途径。本试验结合酶消化法和组织块贴壁法,分离、培养了鹿茸再生干细胞,并对其生物学特点进行分析。利用RT-PCR、RACE等方法对鹿cbfal基因进行克隆,并对其基因和预测氨基酸序列进行生物信息学分析。参考Angela等筛选法则筛选RNAi靶位点,构建并化学合成与载体系统完全匹配的shRNA单链,体外退火连接后插入到载体质粒中,然后与包装质粒、包膜质粒三质粒共转染包装细胞(293T细胞),获得重组慢病毒,通过超滤膜离心管离心浓缩并测定滴度后感染鹿茸再生干细胞,进行微粒体培养,在体外模拟鹿茸的软骨内骨化过程。最后通过荧光定量PCR技术检测cbfal基因沉默的效率以及对Ⅰ型胶原基因表达的影响。成功分离、培养了鹿茸干细胞,该细胞生长潜伏期较短,24h可完全贴壁,3-7d为对数生长期。细胞内有cbfal基因的表达。首次克隆了梅花鹿cbfal基因的编码序列和3’非翻译区序列,编码区共1599bp,与牛、马、野猪、猕猴、人、类人猿、小鼠等有较高同源性,分别达到96%、96%、94%、96%、95%、95%、91%,预测的氨基酸同源性分别达到84%、84%、83%、84%、83%、83%、80%。预测其蛋白质分子量为58.4KD,等电点为9.33,二级结构由螺旋、转角、无规则卷曲和片层组成。按照筛选到的S1-S6 6个RNAi靶位点,化学合成了6对shRNA,成功包装出慢病毒粒子,滴度达到106-108。重组慢病毒成功感染了鹿茸干细胞,并诱导培养成微粒体。荧光定量PCR检测结果表明S1-S6各干扰组与阴性对照组相比,cbfal, collagenⅠ基因的表达量均有下调。其中,下调比例最大的是S6组,对cbfal基因的抑制率达88%,collagenⅠ基因表达量下调86.8%。本试验建立了鹿茸干细胞的微粒体培养体系,模拟鹿茸软骨内骨化的过程,解决了活体试验中耗资大、周期长、对动物损伤较大等缺点,为骨化、骨质疏松等医学领域提供了理想的研究模型；成功克隆了梅花鹿cbfal基因,利用慢病毒介导的RNAi技术,有效地抑制了鹿茸干细胞成骨分化过程中该基因的表达。该基因的沉默,下调了成骨基因的表达,从而抑制了鹿茸干细胞的成骨分化。填补了cbfal调控鹿茸骨化机制的研究空白。为改善鹿茸品质提供了新的手段。